材料与仪器
酵母
YPD YPAD 腺嘌呤半硫酸 TE 乙酸锂
摇床 水浴锅 转子 离心机 培养箱
YPD YPAD 腺嘌呤半硫酸 TE 乙酸锂
摇床 水浴锅 转子 离心机 培养箱
步骤
1. 在开始实验前2天,接种待转化的酵母菌株的单菌落于5 ml YPD培养基中,于30℃恒温摇床,培养过夜。
2. 转化的前一天晚上,往1 L 无菌烧瓶中加入300 ml YPAD培养基,然后接种适量的过夜培养液,再于30℃培养过夜,到细胞密度为1×107 细胞/ml (OD600≈0.3~0.5,依据菌株而定), 为了获得2~3倍高的转化效率,用YPAD稀释培养液至细胞密度为2×106细胞/ml。然后培养生长2~3代(2~4 h)。
3. 培养液在室温条件下,4 000 g 离心5 min,收集细胞。细胞用10 ml 无菌超纯水重悬,然后转移到一个更小一些的离心管中,再于室温下,5 000~6 000 g 离心5 min,沉淀细胞。
4. 细胞用1.5 ml 锂盐溶液重悬,锂盐溶液按下列方法配制,现配现用。
(1)1体积,10×TE缓冲液,pH7.5
(2)1体积,10×乙酸锂贮液
(3)8体积,无菌超纯水
(1)1体积,10×TE缓冲液,pH7.5
(2)1体积,10×乙酸锂贮液
(3)8体积,无菌超纯水
5. 每次转化时,200 μg 担体DNA和≤5 μg 转化DNA一起加入1.5 ml 微量离心管中混匀,DNA的总体积≤20 μl。
6. 往每个离心管加入200 μl 用锂盐溶液重悬的细胞悬液,再加入1.2 ml 新鲜配制的 PEG 4000溶液。PEG 4000溶液配方为:
(1)8体积,50%PEG
(2)1体积,10×TE缓冲液,pH7.5
(3)1体积,乙酸锂贮液
(4)30℃摇荡温育30 min。
7. 于42℃热休克15 min,室温下离心5 s,细胞沉淀用200 μl~1 ml 1×TE缓冲液重悬,并取其中200 μl 涂布在Difco琼脂制备的CM省却成分培养平板上。30℃培养2~5天,直到Difco琼脂平板上出现转化子。
(1)8体积,50%PEG
(2)1体积,10×TE缓冲液,pH7.5
(3)1体积,乙酸锂贮液
(4)30℃摇荡温育30 min。
7. 于42℃热休克15 min,室温下离心5 s,细胞沉淀用200 μl~1 ml 1×TE缓冲液重悬,并取其中200 μl 涂布在Difco琼脂制备的CM省却成分培养平板上。30℃培养2~5天,直到Difco琼脂平板上出现转化子。
来源:丁香实验