材料与仪器
酵母
YPD 磷酸钠缓冲液 甲乙硫醚 刀豆氨酸 硫代硫酸钠
试管 摇床 离心机 平板
YPD 磷酸钠缓冲液 甲乙硫醚 刀豆氨酸 硫代硫酸钠
试管 摇床 离心机 平板
步骤
1. 将过夜培养的待诱变酵母菌株转接于5 ml YPD培养基，于30℃继续培养。检查细胞密度，记录并调整到2×108细胞/ml。
2. 转移1 ml 的菌悬液到无菌的离心管中。高速离心5~10 s，细胞重悬于1 ml 无菌水中，重复洗涤。再用1.5 ml 无菌的0.1 mol/l pH7.0的磷酸钠缓冲液重悬细胞。
3. 在13 mm×100 mm 培养试管中先加入1 ml 缓冲液，然后加入0.7 ml 细胞悬液，剩余细胞在冰浴中保存留作对照。往试管中加入50 μl EMS，在旋涡混合器上振荡使分散均匀，在旋转摇床上于30℃温育1 h。
2. 转移1 ml 的菌悬液到无菌的离心管中。高速离心5~10 s，细胞重悬于1 ml 无菌水中，重复洗涤。再用1.5 ml 无菌的0.1 mol/l pH7.0的磷酸钠缓冲液重悬细胞。
3. 在13 mm×100 mm 培养试管中先加入1 ml 缓冲液，然后加入0.7 ml 细胞悬液，剩余细胞在冰浴中保存留作对照。往试管中加入50 μl EMS，在旋涡混合器上振荡使分散均匀，在旋转摇床上于30℃温育1 h。
4. 将0.2 ml 细胞悬液加入装有8 ml 无菌的5%硫代硫酸钠的培养试管中，灭活EMS，终止诱变。如果细胞在涂布于平板之前打算保存，即可在台式离心机上离心，再用等体积无菌水重悬细胞，4℃保存。
5. 在2个刀豆氨酸平板上分别涂布0.1 ml 诱变细胞悬液，再在同样的刀豆氨酸平板上涂布0.1 ml 未诱变的细胞悬液作对照。于30℃培养直到长出菌落为止（大约需要2~4天），比较诱变后和未诱变的细胞在刀豆氨酸平板上长出的菌落数，计算出抗刀豆氨酸突变的相对水平。
6. 用无菌水按1 ：1 000的比例稀释处理过的细胞，以期在铺平板后每个平板上长出的菌落数约100~200个，取0.1 ml 和0.2 ml 稀释的细胞涂布于2套YPD平板上，毎1套为10个平板，置于室温23℃培养3~4天，如果是进行营养缺陷型筛选，应将平板置于30℃恒温混匀培养。
5. 在2个刀豆氨酸平板上分别涂布0.1 ml 诱变细胞悬液，再在同样的刀豆氨酸平板上涂布0.1 ml 未诱变的细胞悬液作对照。于30℃培养直到长出菌落为止（大约需要2~4天），比较诱变后和未诱变的细胞在刀豆氨酸平板上长出的菌落数，计算出抗刀豆氨酸突变的相对水平。
6. 用无菌水按1 ：1 000的比例稀释处理过的细胞，以期在铺平板后每个平板上长出的菌落数约100~200个，取0.1 ml 和0.2 ml 稀释的细胞涂布于2套YPD平板上，毎1套为10个平板，置于室温23℃培养3~4天，如果是进行营养缺陷型筛选，应将平板置于30℃恒温混匀培养。
7. 从步骤6选择至少10个YPD平板，每个平板含100~200个菌落，然后将每个平板上的菌落影印到2个空白的YPD平板上。如果要筛选温度敏感株，那么可将平板分成2组，一组于37℃培养过夜，另一组于23℃培养过夜。一般来说，要允许影印平板中的一个平板在允许突变株生长的条件下培养，另一个平板则要求在突变型不能生长的条件下培养。
8. 比较37℃和23℃平板，所有在37℃不能生长的菌落均应作为温度敏感突变的候选株。
9. 重复检测一次，从23℃培养的YPD平板上挑出温度敏感的菌株，并将单一的菌落在空白YPD平板上划线。在毎个平板上，要加亲代株作对照，于23℃生长直到菌落形成（2~4天），在每个YPD平板上，可纯化6~8个温度敏感的酵母菌突变株。
10. 单菌落形成后，将温度敏感候选株影印到2个YPD平板上，与第一次影印操作一样，其中一个平板在37℃培养1天，另一个平板于室温培养1天，记录两个平板上菌落的生长情况。
11. 重新鉴定温度敏感候选株并永久保存经过鉴定的温度敏感株。
9. 重复检测一次，从23℃培养的YPD平板上挑出温度敏感的菌株，并将单一的菌落在空白YPD平板上划线。在毎个平板上，要加亲代株作对照，于23℃生长直到菌落形成（2~4天），在每个YPD平板上，可纯化6~8个温度敏感的酵母菌突变株。
10. 单菌落形成后，将温度敏感候选株影印到2个YPD平板上，与第一次影印操作一样，其中一个平板在37℃培养1天，另一个平板于室温培养1天，记录两个平板上菌落的生长情况。
11. 重新鉴定温度敏感候选株并永久保存经过鉴定的温度敏感株。
来源：丁香实验
