IL-6生物学活性检测实验

白细胞介素-6（IL-6）是由活化的辅助性 T 细胞分泌的一种细胞增殖因子，既可作为促炎性细胞因子，又可作为抗炎性因子。

在人类中它是由 IL6 基因编码的，能够刺激活化 B 细胞增殖，分泌抗体，同时刺激 T 细胞增殖及 CTL 活化，刺激肝细胞合成急性期蛋白，参与炎症反应。

MH60.BSF2 为 IL-6 依赖细胞株，MH60.BSF2 细胞增殖量同 IL-6 的生物学活性呈正相比，因此可以用 MTT 分析法，通过测定 MH60.BSF2 细胞的增殖量确定 IL-6 生物学活性单位。

FCS-RPMI-1640 培养液 

谷氨酰胺

HEPES 溶液 

青霉素 

链霉素 

PBSA 缓冲液

离心机 

培养箱 

摇床

MTT（4，5-dimethythiazoyl-zyl2, 5-diphenylterrajolium bromiole）试剂盒

IL-6 标准品

PHA（200 ug/ml）

1、IL-6 的诱生：用于诱导产生 IL-6 的细胞可用 PBMC，诱生剂用 PHA。

PBMC 分泌 IL-2 的诱生：

①人 PBMC 分离：采用常规淋巴细胞分层液浓度梯度离心法分离 PBMC，用 10% FCS-RPMI-1640 培养液调整细胞浓度；

② 加样：接种细胞悬液于 24 孔培养板，每孔 0.5ml，每孔再加 PHA 0.5ml，37 ℃，5% CO₂ 孵育 48 小时。

③ 回收上清：吸出细胞培养上清，12 000r/min 离心 15 分钟，收集上清，-20 ℃ 冻存。

2、IL-6 的生物学活性测定：采用 MH60.BSF2 细胞增殖法。

① MH60.BSF2 细胞制备：取传代培养 24~48 小时对数生长期的 MH60.BSF2 细胞，用培养液离心洗涤 2 次，每次 1000r/min 离心 5 分钟，再用 10% FCS-RPMI-1640 培养液调制细胞浓度为 2.0×10⁵/ml。

② 加样：将细胞接种于 96 孔培养板，每孔 0.1ml。同时将待测样品和标准品做倍比稀释，每孔加入 0.1ml，每个稀释浓度均设 3 复孔。另设培养液对照孔（100ul 细胞+100ul 培养液），37 ℃，5% CO₂ 孵育 48 小时。

③ MTT 掺入：轻轻吸取上清液 100 ul，加 MTT（1 mg/ml）100 ul，37 ℃，5% CO₂ 孵育 2 小时。

测定并计算：离心 2000r/min，5 分钟，吸弃上清液，每孔 100ul DMSO，作用 30 分钟，用酶标测定仪于波长 570nm 测吸光值（A）并绘制标准曲线后，根据标准曲线求出待测样品 IL-6 水平。

1. MH60.BSF2 细胞存活率要保证大于 95%。

2. MTT（4，5-dimethythiazoyl-zyl2, 5-diphenylterrajolium bromiole）要用 PBSA 缓冲液配制成 1mg/ml 浓度工作液，注意 4 度避光保存。