材料与仪器
蛋白质
乙酸 NaOH 丽春红染料 三氟乙酸
纤维素膜 离心管 滤膜
乙酸 NaOH 丽春红染料 三氟乙酸
纤维素膜 离心管 滤膜
步骤
1. 电泳分离目标蛋白并转移到硝酸纤维素膜。
2. 将硝酸纤维素膜放入盛有50 ml 含0.1%丽春红S料的1%乙酸水溶液的经酸洗的petri 玻璃培养皿。轻轻摇动1 min。
3. 将膜移入1%乙酸1 min，如有需要，换液至条带显迹清晰。
3. 将膜移入1%乙酸1 min，如有需要，换液至条带显迹清晰。
4. 穿带无粉尘手套用刀片将目标蛋白条带切下，小心切去多余的硝酸纤维素膜后，放入微量离心管中，取一片空白膜作对照。
5. 将膜放入1 ml 0.2 mmol/l NaOH中，振荡1 min 脱色，吸去NaOH。
6. 立即加入1 ml 含0.5%PVP-40的0.1 mol/l 乙酸中，室温下轻轻摇动管子30 min。
7. 吸去PVP-40，用1 ml 水洗膜5次。小心除去留于管帽下的任何液滴。
6. 立即加入1 ml 含0.5%PVP-40的0.1 mol/l 乙酸中，室温下轻轻摇动管子30 min。
7. 吸去PVP-40，用1 ml 水洗膜5次。小心除去留于管帽下的任何液滴。
8. 用清洁的细头镊子将膜片转移到干净的玻璃表面（如经酸洗的玻璃平板或petri培养皿），切成1~2 mm 的小片，用镊子收集膜片，挤去过量的液体。
9. 立即将膜的碎片移入盛有25 μl 消化缓冲液的0.5 ml 微量离心管中，加入1 μl 1 mg/ml 的胰蛋白酶，混匀使膜均匀地泡于溶液中，室温放置过夜。
9. 立即将膜的碎片移入盛有25 μl 消化缓冲液的0.5 ml 微量离心管中，加入1 μl 1 mg/ml 的胰蛋白酶，混匀使膜均匀地泡于溶液中，室温放置过夜。
10. 室温高速微量离心1 s，回收粘在管壁和盖子上的液滴。
11. 室温超声处理样品5 min。
11. 室温超声处理样品5 min。
12. 室温用最大速度微量离心1 min 将上清移入离心过滤装置，用100 μl 消化缓冲液洗膜碎片，合并于上清，在最大速度微量离心样品20~30 s。
13. 用95%层析A液 / 5%B液，以0.15 ml/min 的流速平衡2.1 mm×250 mm 的反相HPLC柱，有层析炉可用吋，在60℃进行以优化分辨效果。
14. 注射样品，用95%层析A液 / 5%B液洗柱子10~15 min。
15. 用如下的梯度洗脱多肽：5%~40%B液1 h 以上，40%~75%B液30 min 以上，75% ~100%B液15 min 以上，在215 nm 监测多肽的洗脱。
16. 用图形记录仪根据全量程的波型调整至0.05~0.1 AUFS监测多肽洗脱峰的出现。
17. 当图型记录仪开始摆动说明有洗脱峰出现时，对准一干净的表面擦毛细管的尖，用微量离心管收集分部组分。
18. 立即盖好盖子，置于干冰或于-70℃贮存。
19. 加样于按Applied Biosystems所述方法经Polybrene预处理的玻璃纤维滤膜支持体中，进行测序。
来源：丁香实验
