原理
加入一定量的异丙醇或乙醇,基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取出,而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部, 从而达到提取的目的。
材料与仪器
植物组织
抽提缓冲液 十二烷基肌氨酸钠 TE 异丙醇 溴化乙锭 氯化铯
离心机
抽提缓冲液 十二烷基肌氨酸钠 TE 异丙醇 溴化乙锭 氯化铯
离心机
步骤
1. 收取10~50 g 新鲜的植物组织。
2. 植物组织用冷的无菌水洗涤、吸干,放人液氮中冻结,用研钵和研杵研成细粉。
3. 将冻结的细粉放入250 ml 的离心瓶中,立即加入抽提缓冲液约每克植物5~10 ml,轻轻搅拌混匀。
4. 加入十二烷基肌氨酸钠使终浓度达1%,于温育1~2 h。
3. 将冻结的细粉放入250 ml 的离心瓶中,立即加入抽提缓冲液约每克植物5~10 ml,轻轻搅拌混匀。
4. 加入十二烷基肌氨酸钠使终浓度达1%,于温育1~2 h。
5. 用JA-14转子4℃,5 500 g 离心10min 保留上清,必要时重复此歩骤以除去残渣。
6. 加人0.6体积异丙醇,混合,如果看不见沉淀,于-20℃放置30 min,用JA-14转子4℃,7 500 g 离心15 min,弃上清。
7. 沉淀用9 ml TE缓冲液重悬,加入9.7 g 固体氯化铯,混匀,冰上放置30 min,用JA-14转子,7 500 g 离心10 min,保留上清。
6. 加人0.6体积异丙醇,混合,如果看不见沉淀,于-20℃放置30 min,用JA-14转子4℃,7 500 g 离心15 min,弃上清。
7. 沉淀用9 ml TE缓冲液重悬,加入9.7 g 固体氯化铯,混匀,冰上放置30 min,用JA-14转子,7 500 g 离心10 min,保留上清。
8. 加入0.5 ml 10 mg/ml 的溴化乙锭,冰上放置30 min,4℃ 7500 g 离心10min.
9. 将上清转入两个5 ml 的快封超离心管中,并封口。
10. 用VTi80转子20℃ 525 000 g 离心4 h,或20℃,300 000 g 离心过夜,用15号针头和注射器收集带。
11. 用氯化艳饱和的异丙醇重复抽提DNA以除去溴化乙锭。
9. 将上清转入两个5 ml 的快封超离心管中,并封口。
10. 用VTi80转子20℃ 525 000 g 离心4 h,或20℃,300 000 g 离心过夜,用15号针头和注射器收集带。
11. 用氯化艳饱和的异丙醇重复抽提DNA以除去溴化乙锭。
12. 加入2体积水和6体积100%乙醇,混匀,-20℃放置1 h,用JA-20或JA-21转子4℃,7500 g 离心10 min。
13. 沉淀用TE缓冲液重悬,加入1/10体积的3 mol/l 乙酸钠和2体积的100%乙酵重悬,重复离心。
14. 沉淀晾干后用TE缓冲液重悬。
14. 沉淀晾干后用TE缓冲液重悬。
来源:丁香实验