细胞培养技术（成纤维细胞生长因子诱导血管生成模型实验）

肿瘤生成过程中，成纤维细胞生长因子合成和释放增加，参与和诱导血管生成，是一个重要的血管生成诱导剂。因此，以成纤维细胞生长因子为诱导剂，能够促进体内各种模型的血管生成和体外内皮细胞迁移、粘附及增殖，观察药物对这些实验的影响，特别是其抑制作用，可以反映药物的抗血管生成效应。

成纤维细胞
肝素 PBS 牛血清蛋白 FGF
CO2培养箱 96孔培养板 光学显微镜 酶标仪

一、成纤维细胞生长因子和肝素诱导基底膜蛋白提取物内的血管生成模型

1. Matrigel 为一种基底膜提取物，主要由粘连蛋白、胶原蛋白、硫酸肝素。蛋白多糖和 nidogen/entactin 构成，经滤膜，制备成无菌液体。

2. 肝素溶解于无菌的PBS（pH7.4）中，浓度为16 000单位/ml，酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）经预先配备的无菌牛血清清蛋白/PBS溶液稀释为0.25 ug/ml。

3. 于4℃把各种浓度的肝素或FGF与0.5~1.0ml 的 matrigel 混合，前者体积不超过后者的1%。

4. 把含有0~100 ng/ml aFGFHE 0~64 ug/ml 肝素的0.5 ml matrigel 用21号针注射到C57小鼠腹白线皮下。

5. 注射后matrigel 在皮下迅速形成单一的固体胶，10天后乙醚麻醉小鼠，沿腹白线剪开皮肤，剥离出胶块。

6. 一部分应用Drabkin’方法进行血红蛋白测定，另一部分经过10%中性福尔马林固定、石蜡包埋、切片、染色。

7. 于光镜下进行组织学检查，记录血管形成的数量。

8. 近年来，还有圆盘状血管生成系统、大鼠海绵血管生成模型等用于抗血管生成药物体内试验。

二、内皮细胞粘附分析

1. 把对数生长期的内皮细胞，用无血清培养液洗三次，收集并重新悬浮含有0.1%BSA的无血清培养液中，浓度为5×10⁵细胞/ml。

2. 也可预先将细胞与无血清培养液稀释的不同浓度抑制剂在室温下，孵育60 min。

3. 将细胞种入96孔培养板内（10 ul/孔），与37℃孵育30~90 min。

4. 用Dulbecco‘PBS液清洗细胞4 次，除去未粘附细胞，粘附细胞用20%甲醇稀释的0.5%结晶紫染色、固定、漂洗和空气晾干。

5. 用比例为1：1的乙醇和0.1 mol/l 构橼酸钠溶液洗涤染色细胞，用酶标仪在540 nm 测定吸收度（OD）。