细胞培养技术（小鼠腹腔巨噬细胞培养实验）

取小鼠腹腔巨噬细胞与乳胶颗粒在不同培养条件下混合后定量加入 24 孔板，37 ℃，5% CO₂ 培养箱中孵育后，荧光显微镜下计数吞噬百分率和吞噬指数。

小鼠、1640 培养基、小牛血清、双抗

台盼兰手术器械、一次性注射器

眼科镊、眼科剪、96 孔板、CO₂ 培养箱

一、实验步骤

1. 如果采用刺激物，则可在实验前三天腹腔注射 3% 巯基乙醇酸钠每只 2 mL，获得的巨噬细胞数要多一些。不采用刺激物，直接开始下面的步骤。

2. 拉颈处死小鼠，在 75% 酒精浸泡 1~2 分钟，移入超净台中，仰卧位固定于解剖板上，碘酒消毒腹部皮肤，酒精绵球脱碘。用手术直剪充分剪开腹部皮肤，暴露腹部肌层，再用酒精绵球消毒腹部肌层。

3. 用注射器抽取 5 mL 含双抗的 RPMI 1640 培养基注入腹腔，用绵球轻揉腹部 1~2 min，然后，用眼科镊稍提起腹腔，并用眼科剪剪开一个小口，用吸管吸取细胞悬液，移入离心管中。

4. 1000 rpm 离心 5 min 后，用含双抗的 RPMI 1640 培养基洗涤一次，再次离心，重悬细胞于含 10% 小牛血清的 RPMI 1640 培养液中，如果是作为饲养细胞使用，则选择相应的培养液。台盼蓝拒染法计数，将细胞稀释到目的浓度后，接种即可。

5. 如果是作为饲养细胞使用，调整浓度至 2x10⁵ 个/mL，接种到 96 孔板中，每孔 100~200 μL；如 果作为其它实验使用，可以调整成 2x10⁶/mL，加到 24 孔平底培养板中，1 mL/孔；5% CO₂ 温箱孵育 2 h 后， 换液，并用 RPMI 1640 培养基洗 1~2 次，弃去未粘附细胞，贴壁细胞为单层的巨噬细胞。

二、结果

巨噬细胞刚贴壁时偏圆形，或者类似鹅卵石形状，然后慢慢伸出伪足，铺开呈三角形或多角形。巨噬细胞有吞噬的特性，当与细菌混合在一起的时候，在40 倍物镜下可以看到巨噬细胞吞噬细菌，因此，巨噬细胞作为饲养细胞可以清除部分污染的细菌、支原体和部分细胞碎片。

1. 严格无菌操作，在超净台内进行；

2. 为避免交叉感染，每一只小鼠更换注射器；

3. 吸管吸取细胞悬液的时候，尽量不要吸到大小肠，否则容易引起成纤维细胞污染。

巨噬细胞一般没有特殊的鉴定方法，有两条经验：

1. 巨噬细胞是终末分化细胞，不会增殖

2. 很难消化下来，所以接种的时候，必须直接接种到目的培养器皿中。