原理
液氮研磨可裂解细胞,促使核蛋白体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时,它可抽提酸性的苯酚,而酸性苯酚可促使RNA进入水相,离心后可形成水相层和有机层,这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。
材料与仪器
菌丝体
NaCl 蒸馏水 SDS Tris-HCl EDTA DEPC SSTE 乙醇 酒精 酚:氯仿:异戊醇 LiCl
液氮罐 离心管 离心机 水浴锅 冰箱 紫外分光光度计 电泳仪
步骤
8. 弃上清,用500 ul SSTE溶解沉淀。
注意事项
提取RNA请尽量在低温下操作,如果条件不容许,在室温下操作的时间要尽可能的短。
常见问题
实验试剂准备
1. RNA提取缓冲液(CTAB):2% CTAB(W/V),2% 聚乙烯吡咯烷酮PVP(W/V),100 mM Tris-HCl(pH8.0,DEPC处理的水配置),25 mM EDTA,0.5 g/L 亚精胺Spermidine,2.0 M NaCl,2%巯基乙醇(V/V,使用前加入)。由于在高温灭菌条件下,Tris-HCl要和DEPC发生反应,所以配RNA提取缓冲液时直接用DEPC处理的水配制即可。
2. SSTE:1 M NaCl,0.5% SDS(W/V),10 mM Tris-HCl pH8.0,1.0 mM EDTA。
3. 10 M LiCl 直接用蒸馏水配10 M LiCl,加1‰的DEPC过夜后,高温灭菌。
4. DEPC处理水 用1‰的DEPC处理蒸馏水过夜,高温灭菌。
5. 3M NaAc,氯仿:异戊醇(24:1),酚(pH4.5):氯仿:异戊醇(25:24:1),无水乙醇,70%酒精。
来源:丁香实验