原理
10只BALB/C裸鼠前列腺背侧包膜内注入携带红色荧光蛋白（RFP）的前列腺癌PC-3细胞（PR7细胞）悬液20μL，第2、4、6、8周分别用非侵入式活体分子影像系统观察前列腺原位肿瘤发生及其转移情况。尸检取前列腺原位肿瘤、肺、肝、肾、股骨、盆腔淋巴结等组织，制成冰冻切片，通过荧光显微镜下观察及HE染色等方法分别检测肿瘤发生及有无转移等情况。
材料与仪器
BALB C裸鼠 前列腺癌PR7细胞系
饲料 饮用水 胰酶 EDTA Hank平衡盐溶液 水合氯醛 多聚甲醛 苏木素-伊红
孵箱 倒置荧光显微镜 冻存管 棉签 针头 光学显微镜 注射器 非侵入式活体分子影像系统
饲料 饮用水 胰酶 EDTA Hank平衡盐溶液 水合氯醛 多聚甲醛 苏木素-伊红
孵箱 倒置荧光显微镜 冻存管 棉签 针头 光学显微镜 注射器 非侵入式活体分子影像系统
步骤
一、实验材料准备
1. 雄性BALB/C裸鼠10只，6周龄，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。饲养SPF条件下超净层流架内，饲料及饮水自由摄入。
1. 雄性BALB/C裸鼠10只，6周龄，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。饲养SPF条件下超净层流架内，饲料及饮水自由摄入。
2. 稳定表达红色荧光蛋白（前列腺癌PR7细胞系）用含5%胎牛血清（体积分数）（杭州四季青生物工程有限公司）的RPMI-1640培养基（美国Gibco公司）在37、5% CO2（体积分数）孵箱内培养，0.25%胰酶+0.02% EDTA混合液（体积分数）消化及传代。
二、RFP表达情况
二、RFP表达情况
倒置荧光显微镜下观察前列腺癌PC-3及PR7细胞RFP表达情况。
三、前列腺原位肿瘤模型的建立
1. 对数生长期PR7细胞用0.25%胰酶+0.02% EDTA混合液（体积分数）消化，Hank平衡盐溶液（HBSS）洗涤离心后重悬制备2×107/mL细胞悬液，移入无菌细胞冻存管带至实验动物中心备用。
2. 裸鼠用10%水合氯醛（体积分数）（4 mL/mg）腹腔注射麻醉后固定，碘伏消毒皮肤后取下腹正中纵切口1 cm，暴露膀胱及精囊腺，棉签辅助充分暴露前列腺。
3. 一次性1 mL胰岛素注射器29G针头斜面向上小心刺入前列腺包膜内，缓慢注入上述细胞悬液20 μL，可见前列腺包膜明显鼓起且无外渗，退出针头，恢复脏器解剖位置，7-0可吸收缝线间断缝合肌层，4-0丝线缝合皮肤。
4. 待裸鼠苏醒后回笼。
2. 裸鼠用10%水合氯醛（体积分数）（4 mL/mg）腹腔注射麻醉后固定，碘伏消毒皮肤后取下腹正中纵切口1 cm，暴露膀胱及精囊腺，棉签辅助充分暴露前列腺。
3. 一次性1 mL胰岛素注射器29G针头斜面向上小心刺入前列腺包膜内，缓慢注入上述细胞悬液20 μL，可见前列腺包膜明显鼓起且无外渗，退出针头，恢复脏器解剖位置，7-0可吸收缝线间断缝合肌层，4-0丝线缝合皮肤。
4. 待裸鼠苏醒后回笼。
五、非侵入式活体分子影像系统监测原位肿瘤及转移情况
术后第2、4、6、8周分别用非侵入式活体分子影像系统（美国Xenogen公司）监测原位肿瘤形成、生长及转移情况。
六、病理检查
1. 术后6～8周，所有裸鼠均出现恶液质。
2. 颈椎脱臼法处死，取前列腺原位肿瘤、肺、肝、肾、股骨、盆腔淋巴结。
3. 分别做冰冻切片各2张，切片厚度为10 μm。
4. 各组织分别取1张滴加DAPI（4′，6－二脒基－２－苯基吲哚）染色2 min，用PBS洗3次、每次3 min。
5. 荧光显微镜下观察，绿光激发红光，紫外光激发蓝光。
6. 以原位肿瘤为阳性对照。
7. 另1张用4%多聚甲醛固定10 min后苏木素－伊红（HE）染色，普通光镜下寻找转移灶。
2. 颈椎脱臼法处死，取前列腺原位肿瘤、肺、肝、肾、股骨、盆腔淋巴结。
3. 分别做冰冻切片各2张，切片厚度为10 μm。
4. 各组织分别取1张滴加DAPI（4′，6－二脒基－２－苯基吲哚）染色2 min，用PBS洗3次、每次3 min。
5. 荧光显微镜下观察，绿光激发红光，紫外光激发蓝光。
6. 以原位肿瘤为阳性对照。
7. 另1张用4%多聚甲醛固定10 min后苏木素－伊红（HE）染色，普通光镜下寻找转移灶。
常见问题
一、实验讨论
随着荧光蛋白的发现及其在生物医学领域的广泛应用和动物活体荧光成像技术的发展，在不处死动物的情况下动态观察原发肿瘤的形成、生长及转移发生的情况成为可能。应用于标记肿瘤细胞的荧光蛋白主要有RFP和绿色荧光蛋白（green fluorecent protein）。RFP与GFP相比，激发和发射波长较长，且其发射峰位于培养基、培养器材及细胞成分等产生的荧光背景范围之外，具有较高的信噪比和灵敏度；而且在细胞内荧光转换效率高，更易检测。故本实验选用RFP标记的前列腺癌PR7细胞原位接种于前列腺包膜内，然后用非侵入式活体分子影像系统连续活体观察荧光信号及其强度的变化来监测原位肿瘤的形成、生长及转移过程。
目前研究应用较多的前列腺肿瘤模型有皮下接种、前列腺原位接种及血管内接种等模型。将人前列腺癌细胞直接接种于裸鼠皮下的方法简便易行、易于观察，但极少发生自发转移；血管内接种有尾静脉注射及左心室内接种两种方法，此法由于没有原发灶的形成及肿瘤细胞从原发灶分离并侵入血管或淋巴管而发生转移等重要过程而未被广泛采用；前列腺肿瘤原位接种模型］的建立方法又可分为前列腺包膜内原位注射细胞悬液及原位瘤块移植两种。原位瘤块移植需先于裸鼠皮下种植肿瘤细胞悬液，待其成瘤后取瘤块剪碎再通过显微外科技术将瘤块移植入裸鼠前列腺内，该方法增加了皮下成瘤的步骤，不同裸鼠移植的瘤块大小不易控制，且对手术技术要求较高。因而我们采用前列腺包膜内直接注射肿瘤细胞悬液的方法来构建前列腺原位肿瘤模型，该模型由于能较好地模拟前列腺肿瘤发生发展的病理生理过程，且简便易行，是构建前列腺原位肿瘤模型的重要方法。
本实验用非侵入式活体分子影像系统于原位注射肿瘤细胞悬液后第2、4、6、8周连续观察同一批裸鼠前列腺原位肿瘤的形成及生长情况，发现术后第2周体外尚不能触及肿瘤的情况下已有代表肿瘤细胞的红色荧光信号，且随着肿瘤体积的不断增大，荧光信号也越来越强。说明非侵入式活体分子影像系统对于监测前列腺原位肿瘤形成及生长有较高的灵敏度，可行性强，成功建立了可活体监测前列腺原位肿瘤发生发展的动物模型。另外，传统病理证实肿瘤或转移灶的方法为石蜡包埋后切片HE染色观察。
本实验中用于构建前列腺原位肿瘤模型的前列腺癌PR7细胞可稳定表达RFP，故我们处死动物后立即取标本做冰冻切片，然后用荧光显微镜观察原位肿瘤及可能发生转移的组织器官，结果证实原位肿瘤观察到红色荧光，而各组织器官均未发现转移灶，与HE染色病理结果相符。该方法直观且简便易行，可在用标记荧光蛋白的肿瘤模型的研究中发挥重要作用。
本实验中用于构建前列腺原位肿瘤模型的前列腺癌PR7细胞可稳定表达RFP，故我们处死动物后立即取标本做冰冻切片，然后用荧光显微镜观察原位肿瘤及可能发生转移的组织器官，结果证实原位肿瘤观察到红色荧光，而各组织器官均未发现转移灶，与HE染色病理结果相符。该方法直观且简便易行，可在用标记荧光蛋白的肿瘤模型的研究中发挥重要作用。
本实验建立的前列腺肿瘤模型，并未发现明显自发转移灶，可用于前列腺癌的发生机制及筛选抗肿瘤药物的基础研究，但局限了其在前列腺癌转移过程及机制的研究中的应用，可能与裸鼠存活时间过短及细胞系的选择等因素有关。对于有更高自发转移发生率的前列腺原位肿瘤的模型的建立，有待进一步探索。
来源：丁香实验
