原理
人胃癌细胞悬殊液接种于裸鼠皮下，形成稳定传代的皮下移植瘤，将皮下移植瘤组织再接种于裸鼠胃浆膜下，称为间接胃原位移植模型，并与直接用细胞悬液接种于裸鼠胃浆膜下、皮下、腹腔、尾静脉的移植瘤模型比较，观察移植肿瘤的生长状况、移植成功率和自发转移的发生率及组织学变化及细胞动力学改变等生物学特性。
材料与仪器
BLAB C-nu nu小鼠 GC9811细胞
水 饲料 乙醇 甲醛 液氮 石蜡
超净层流架 手术刀 丝线 荷包 冰箱 光学显微镜 流式细胞仪
水 饲料 乙醇 甲醛 液氮 石蜡
超净层流架 手术刀 丝线 荷包 冰箱 光学显微镜 流式细胞仪
步骤
一、实验材料准备
BLAB/C-nu/nu小鼠，鼠龄3-5 wk，雌雄兼用，其实验和饲养均在SPF条件下的超净层流架中进行，灭菌水和饲料供动物自由摄入。GC9811常规传代。
二、
1. 收集体外培养的对数生长期的GC9811细胞，调节细胞数为1×1010L-1，每只裸鼠取0.2 mL注入右大腿背侧皮下，当皮下移植瘤长至直径为1.5 cm左右时取出移植瘤，瘤组织用锋利的小刀切成约0.1 cm直径的小块，选择已禁食12 h的10只裸鼠，术前用乙醚吸入麻醉。
2. 常规消毒皮肤，选择左侧正中旁切口，打开腹腔将胃拉出，用5.0丝线对胃大弯侧前壁浆膜层做荷包缝合（直径约 cm）用小手术刀细心划伤荷包中心胃壁浆膜层，然后将预先切好的3-4块瘤组织包埋入囊内，扎紧荷包缝线，缝合腹膜（含肌层）及皮肤。
3. 当裸鼠处于濒死状态时，将其中1只用颈椎脱位术处死， 取出移植瘤，一部分瘤组织以原代移植方法行鼠间连续原位传代（每次传代5-10只裸鼠），按上述方法收集细胞、打开裸小鼠腹腔，于裸鼠胃窦大弯侧中部的胃壁浆膜下注射GC9811 细胞悬液0.2 mL，并可见浆膜下鼓起一透亮小泡为标志，停留数秒钟后抽出针头，并用750 mol L-1乙醇棉球擦拭注射部位及其附近的胃浆膜面，以杀死溢流出来的瘤细胞。
4. 将胃送回腹腔并用4.0号手术缝线缝合腹壁肌层及皮肤。
5. 同前收集细胞悬液，腹腔移植瘤模型的裸鼠与尾静脉移植瘤模型的裸鼠分别于腹腔内、尾静脉各注入GC9811 细胞悬液0.2 mL，皮下移植瘤模型的建立同前。
6. 移植后的裸鼠分组分笼于SPF条件下饲养，逐日观察，待荷瘤裸饲养至濒死状态或自然死亡，解剖观察，记录肿瘤侵润和转移情况，对移植瘤和接种瘤分别观察并测量瘤体的长（L）、宽（W）、高（H），用公式V=π/6（L×W×H）计算其体积。
7. 标本经40 gL-1的中性甲醛固定，常规石蜡切片，光镜检查。
8. 余下瘤组织液氮冻存备用。
9. 裸鼠处死前，采用摘眼球方法采集血液，及时分离血清检测或-200℃冰冻保存待测，以正常裸鼠血清为对照，用放免分析法检测血清中CEA的含量。
10. 制备单细胞悬液，调整细胞密度至1×1010L-1，4℃，750 mol L-1乙醇固定，染色，流式细胞仪测定。
11. 采用Barlogie细胞同期分析法，将处于不同时期的细胞分为G1，S，G2期细胞。
12. 以正常组织对照按公式（DI=肿瘤组织G1峰值/正常组织G1峰值）计算DNA指数。
13. 实验数据用x±s 表示，采用t检验检测各组之间的差别。
14. 移植的肿瘤在原位均有生长，术后3 wk左右于裸鼠上腹部可扪及直径约2-3 mm质地较硬的结节，6-7 wk 时上腹部可扪及较明显的肿块，动物衰竭明显，荷瘤鼠生存时间6-9（平均7.5）wk。 移植瘤呈结节状，质地较硬，大小为0.4 cm×0.3 cm×0.3 cm-2.6 cm×1.8 cm×1.9 cm，病理证实癌细胞侵袭胃壁固有肌层及胃腔表面粘膜层，肝内转移，淋巴结转移。
BLAB/C-nu/nu小鼠，鼠龄3-5 wk，雌雄兼用，其实验和饲养均在SPF条件下的超净层流架中进行，灭菌水和饲料供动物自由摄入。GC9811常规传代。
二、
1. 收集体外培养的对数生长期的GC9811细胞，调节细胞数为1×1010L-1，每只裸鼠取0.2 mL注入右大腿背侧皮下，当皮下移植瘤长至直径为1.5 cm左右时取出移植瘤，瘤组织用锋利的小刀切成约0.1 cm直径的小块，选择已禁食12 h的10只裸鼠，术前用乙醚吸入麻醉。
2. 常规消毒皮肤，选择左侧正中旁切口，打开腹腔将胃拉出，用5.0丝线对胃大弯侧前壁浆膜层做荷包缝合（直径约 cm）用小手术刀细心划伤荷包中心胃壁浆膜层，然后将预先切好的3-4块瘤组织包埋入囊内，扎紧荷包缝线，缝合腹膜（含肌层）及皮肤。
3. 当裸鼠处于濒死状态时，将其中1只用颈椎脱位术处死， 取出移植瘤，一部分瘤组织以原代移植方法行鼠间连续原位传代（每次传代5-10只裸鼠），按上述方法收集细胞、打开裸小鼠腹腔，于裸鼠胃窦大弯侧中部的胃壁浆膜下注射GC9811 细胞悬液0.2 mL，并可见浆膜下鼓起一透亮小泡为标志，停留数秒钟后抽出针头，并用750 mol L-1乙醇棉球擦拭注射部位及其附近的胃浆膜面，以杀死溢流出来的瘤细胞。
4. 将胃送回腹腔并用4.0号手术缝线缝合腹壁肌层及皮肤。
5. 同前收集细胞悬液，腹腔移植瘤模型的裸鼠与尾静脉移植瘤模型的裸鼠分别于腹腔内、尾静脉各注入GC9811 细胞悬液0.2 mL，皮下移植瘤模型的建立同前。
6. 移植后的裸鼠分组分笼于SPF条件下饲养，逐日观察，待荷瘤裸饲养至濒死状态或自然死亡，解剖观察，记录肿瘤侵润和转移情况，对移植瘤和接种瘤分别观察并测量瘤体的长（L）、宽（W）、高（H），用公式V=π/6（L×W×H）计算其体积。
7. 标本经40 gL-1的中性甲醛固定，常规石蜡切片，光镜检查。
8. 余下瘤组织液氮冻存备用。
9. 裸鼠处死前，采用摘眼球方法采集血液，及时分离血清检测或-200℃冰冻保存待测，以正常裸鼠血清为对照，用放免分析法检测血清中CEA的含量。
10. 制备单细胞悬液，调整细胞密度至1×1010L-1，4℃，750 mol L-1乙醇固定，染色，流式细胞仪测定。
11. 采用Barlogie细胞同期分析法，将处于不同时期的细胞分为G1，S，G2期细胞。
12. 以正常组织对照按公式（DI=肿瘤组织G1峰值/正常组织G1峰值）计算DNA指数。
13. 实验数据用x±s 表示，采用t检验检测各组之间的差别。
14. 移植的肿瘤在原位均有生长，术后3 wk左右于裸鼠上腹部可扪及直径约2-3 mm质地较硬的结节，6-7 wk 时上腹部可扪及较明显的肿块，动物衰竭明显，荷瘤鼠生存时间6-9（平均7.5）wk。 移植瘤呈结节状，质地较硬，大小为0.4 cm×0.3 cm×0.3 cm-2.6 cm×1.8 cm×1.9 cm，病理证实癌细胞侵袭胃壁固有肌层及胃腔表面粘膜层，肝内转移，淋巴结转移。
常见问题
采用人胃癌细胞系GC9811裸鼠皮下移植瘤组织块为材料，原位移植于裸鼠胃壁，成功建立了人胃癌皮下-胃原位移植转移模型，瘤率100%，肝脏转移率较瘤细胞悬液法原位移植模型明显增加。 所有模型未见肺脏转移，而尾静脉注射瘤细胞后仅见肝脏转移，可能为GC9811本身不具备肺脏转移的生物学特性。 裸鼠器官微环境的不同，表现出移植瘤转移率存在显著差异。裸鼠的原位移植颇似临床患者的转移特点，且转移率高，更客观地模拟了胃癌患者的体内侵袭和转移特性。 除在组织学、倍性分析上与胃癌低分化腺癌一致，保持了产生CEA 的功能，是一个生物学特征较稳定的人胃癌裸鼠皮下—胃原位移植转移模型。胃癌在我国居恶性肿瘤之首，晚期预后差，长期存活率较低，迫切需要建立探究胃癌机制的模型。
来源：丁香实验
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