纤维蛋白原-凝血酶法

一、实验材料准备
 

BALB /C nu /nu裸鼠12只，雌雄兼用， 4～6周龄，体质量18～20 g，SPF级条件下饲养。传代于裸鼠皮下的SGC-7901人胃癌细胞株。
 

二、裸鼠皮下移植瘤的建立和传代　
 

1.  收集体外培养的SGC-7901细胞，使细胞含量为5 x10⁷ /ml，制成细胞悬液然后取0. 2 ml注入裸鼠颈背部皮下。

2.  当皮下移植瘤长至直径为1 cm左右时无菌操作取出移植瘤，去除坏死组织，漂洗后，将瘤组织切成约1～2 mm的小块，研磨过滤制备成单细胞悬液局部注入另一只裸鼠颈背部皮下，如此成瘤后鼠间反复传5代。
 

三、原位移植模型的建立　
 

1.  将第5代致瘤的裸鼠脱颈处死后无菌操作取出第5代皮下移植瘤，剔除纤维包膜和坏死组织，选取生长良好呈淡红色鱼肉状的瘤组织用眼科剪切成1 mmx1 mm x2 mm的小块，浸泡于已配好的纤维蛋白原溶液中置于冰袋上备用。

2.  实验裸鼠术前禁食，以1 ml氯胺酮( 5 g/ml)腹腔注射麻醉后，固定四肢并进行常规皮肤消毒，选腹左侧正中切开皮肤1. 5 cm，逐步进腹，显露胃壁后将胃拉出，在胃大弯处近胃窦旁用1 ml无菌空针头划破胃壁浆肌层，植入3～4块瘤组织块，并在瘤表面滴上约10 μl凝血酶，使其覆盖瘤组织表面，约10 s左右待凝血酶与纤维蛋白原发生反应形成胶状物后，瘤组织块黏合在胃壁破损处，然后将胃壁口纳入腹腔。

3.  分别采用6-0缝合线缝合腹膜(含肌层) ，3-0缝合线缝合腹壁，关腹结束手术，以上操作均在超净台内进行，共建6例模型。
 

四、原位移植致瘤率及移植瘤侵袭和转移情况观察　

1.  移植术后精心饲养， 定时观察所有裸鼠全身状况、进食情况、运动情况和腹部体征。

2.  当荷瘤鼠出现消瘦、精神萎靡及弓背等全身衰竭体征时，脱颈处死，探查腹腔中瘤体生长状况、有无腹腔积液形成及周围脏器受累情况。

3.  然后留取原位瘤组织，胸腹腔重要脏器胃、肺、肝、腹膜等组织，用10%甲醛固定后，石蜡包埋、切片、HE染色，进行组织病理学检查。

4.  原位瘤组织中增殖细胞核抗原( PCNA)的检测采用免疫组化染色( SP法) ，细胞核染成棕黄色为阳性细胞，阳性结果判断标准：随机取5个高倍视野，以其阳性细胞百分比来判定，≤5% ( - ) ，6% ～25% ( + )，26%～50% ( + + ) ，≥51% ( + + + ) 。

一、实验讨论

建立一种符合人体胃癌组织自然生长状态的侵袭和转移的理想模型是研究胃癌发病机制及防治措施的关键所在。最初的人胃癌裸鼠皮下移植瘤尽管在形态、生化特征及功能方面与人胃癌十分相似，但是由于肿瘤组织周围结缔组织的包裹等因素限制了肿瘤的转移，从而不能较真实地模拟人体内胃癌的发生与发展。随着实验方法的不断改进，原位移植模型能够克服皮下移植模型的不足，它在肿瘤的浸润及转移上更接近临床人胃癌发展的基本规律，与皮下移植模型相比具有显著的优越性。此后，人们又发现胃癌组织块原位移植模型与癌细胞悬液原位移植模型相比，具有更高的移植成功率及转移率，尤其是OB胶用于胃癌组织原位移植造模方法，使实验操作更为简便， 建模成功率更高。目前，OB胶粘贴法 已广泛运用于模拟人胃癌临床转移的原位移植模型的构建，它具有原位移植的优点，不仅保持了癌组织结构的完整性，并且使建模操作相对简便，术中出血少，术后恢复快，明显提高了动物存活率，为人类胃癌的生长、转移机制及治疗方面的研究提供了一种较理想的模型。

 

然而，OB胶是一种化学胶,在临床上主要应用于外科手术中创面及吻合口的封闭，它在人体内并不能完全被吸收，因此在肿瘤模型中可能影响肿瘤组织的外生性生长，易使模型中肿瘤组织中心形成大片坏死。在人体凝血过程中，纤维蛋白原与凝血酶反应能够形成纤维蛋白固化物，发挥有效的止血作用。利用这一原理，作为多功能生物高分子的纤维蛋白已在生物工程中的组织再生及伤口愈合中被广泛地应用，它不仅能够止血和使局部伤口组织粘连，还能被机体吸收从而不会影响肿瘤细胞的生长。此外，凝血酶能促进肿瘤血管的形成和肿瘤微环境的组织重建，为肿瘤的转移提供一个相容的环境。因此，我们利用纤维蛋白原和凝血酶的反应物纤维蛋白作为OB胶的替代物来粘贴移植手术中的组织块从而进行模型的建立。我们的研究结果表明，纤维蛋白原- 凝血酶 粘贴法建立的裸鼠胃癌原位移植模型具有较高的原位移植成功率，肿瘤生长迅速且较少出现坏死， 6例模型中有5例出现重要脏器的转移、3例动物模型出现腹腔积液，因此我们认为此法能够成功再现人体胃癌的临床转移过程，为人类胃癌的生长及转移机制的研究提供一种理想的动物模型。