Matrigel 基质膜模型

1.  溶胶，4℃过夜。

2.  室温下基质胶易成凝胶，所以，步骤2和3种使用试管和枪头要在试验前-20C预冷。

二、 包被基底膜（冰上操作）

1.  用无血清的冷细胞培养基DMEM稀释Matrigel胶。

2.  取100 ul稀释胶加到24-well transwell上室中。

3.  37℃孵育transwell至少4-5 h 。

三、 水化基底膜

1.  用无血清培养基轻洗凝胶 。

四、准备细胞悬液和小室

1.  消化法从细胞培养瓶中获取细胞。

2.  用培养基洗3遍。

3.  重悬细胞，5×10⁵cells/ml，1% FBS 。

4.  上室加200 ul细胞悬液。

5.  下室中加入600 ul细胞培养基，含有5 ug/ml fibronectin作为黏连亚族。

五、 孵育

37℃，20 - 24 h 。

六、 染色和计数

1.  棉签擦去上室上面的非侵袭细胞。

2.  移去transwells，倒置，风干。

3.  24孔板中加入500 μl含0.1%结晶紫，将小室置于其中，使膜浸没在培养基中，37℃ 30min后取出，PBS清洗。

4.  直径上取4个视野，照相，计数。

5.  24孔板中加入500 μl 33%醋酸，将小室置于其中，浸膜，振荡10 min，充分溶解。取出小室，24孔板于酶标仪上570nm测OD值，间接反应细胞数。

溶液配制

1.  DMEM

（1）NE---A液（1 μg/μl，1 mg/ml）

（2）母液0.1 ml（5 mg）+ ddH2O up to 5 ml ；过滤消毒，-20℃保存。

2.  NE-DMEM（-6 M）

NE---A液（1 μg/μl，1 mg/ml） 20.5 μl

DMEM UP TO 100 ml

过滤消毒，4℃保存

3.  NE+CGRP-DMEM（-6 M，100 ng）

（1）NE---A液（1 μg/μl，1 mg/ml） 20.5 μl

（2）CGRP-储存液 50 μl

（3）DMEM UP TO 100 ml

（4）过滤消毒，4℃保存

4.  NE+IFN-DMEM（-6 M，50 ng）

（1）NE---A液（1 μg/μl，1 mg/ml） 20.5 μl

（2）IFN-γ（25ng/μl） 25 μl

（3）DMEM UP TO 100 ml

（4）过滤消毒，4℃保存。

5.  低血清DMEM培养基（上室）

6.  20%FBS-DMEM培养基（下室）

7.  Matrigel 基质胶

（1）10 mg/ml，5 ml，分装成0.5 ml/只10个EP管中。

（2）用时加入0.5 ml的DMEM。

（3）Matrivgel在冰上维持液态，室温时可迅速凝结成胶。