原理
本实验用Dynabeads protein A 进行免疫复合物的纯化。Dynabeads A 蛋白 （Dynabeads Protein A） 在免疫沉淀中有以下作用：
（1）将方案时间减少到 30 分钟。
（2）显著降低非特异性结合造成的背景
（3）保持蛋白质复合物的完整。对珍贵的蛋白质没有物理压力。
材料与仪器
肿瘤细胞
PBS 生理盐水 裂解液 蛋白酶抑制剂
培养瓶 细胞刮棒 离心管 低温离心机 -80℃冰箱 探针型超声波 恒温水浴锅
PBS 生理盐水 裂解液 蛋白酶抑制剂
培养瓶 细胞刮棒 离心管 低温离心机 -80℃冰箱 探针型超声波 恒温水浴锅
步骤
一、 裂解细胞
1. 方向刮取细胞。将细胞悬液转移到离心管，离心取沉淀，-80℃ 保存。（收集细胞要迅速，低温下进行，以减弱蛋白酶的作用）
2. 裂解细胞。采用RIPA 裂解体系，使用前40℃ 预冷，按107 个细胞加入1.0 ml 裂解液，吹打混匀，加入适量的蛋白酶抑制剂
（如cocktail）， 冰上放置3~5 分钟。
3. 超声处理裂解液。使用探针型超声进行多次适当频率的短促冲击，10~20秒/次，重复3 次，中间间隔10~20 秒，冰浴下进行。
4. 15 000 rpm，40℃离心15 min，吸取上清液于另一EP管中，置冰上。上清液用于下一步的预处理。
二、裂解物的预处理
使用正常人的血清对裂解物进行预处理。
1. 按1 ml 裂解物加2 ul 对照血清的比例加入正常人血清。
2. 室温孵育2~3 小时，缓慢摇动。
三、免疫复合物的纯化
1. 用Dynabeads protein A 进行免疫复合物的纯化。
2. 将Dynabeads protein A 振荡混匀，吸取100 ul 磁珠于EP 管中，置于磁铁架（Dynal MPC）上，磁珠吸附到管壁上，弃上清。
3. 加500 ul 0.1 M Na-phosphate (pH8.1 )至Ep 管，轻柔搓动管子约2~3 min，将EP管置于磁铁架上，磁珠吸附到管壁上，弃上清。
4. 重复2 步骤两次。
5. 清洗完磁珠后，加500 ul 预处理后的裂解物，反复摇动管子，室温下反应10~20 min。
6. 将EP管置于磁铁架上，磁珠吸附到管壁上，将上清转移至另一EP管中。
7. 用RIPA 裂解液清洗磁珠3 次。
8. 洗脱抗原-抗体复合物。加0.1 M citrate (pH3.1) 30 ul于Ep 管中，轻柔搓动管子约2~3 min，将P管置于磁铁架上，吸取上清于一EP管。
9. 重复步骤7，将上清收集于同一个EP管洗脱样品总体积为60 ul，作对照用。
10. 磁珠用0.1 M Na-phosphate (pH8.1 ) 清洗三次后备用。
11. 在步骤5 留取的上清中加入病人血清（1 ml 加2 ul 血清），缓慢摇动，室温孵育2~3 h。
12. 将EP管置于磁铁架上，磁珠吸附到管壁上，弃上清。
13. 重复步骤6~8。共收集到两份样品，对照与病人的纯化免疫复合物各60 ul。
14. 磁珠用0.1 M Na-phosphate (pH8.1 ) 清洗三次后加入柱储液100 ul，40℃ 保存。
15. 在样品中加入2xSDS 上样缓冲液并用1 M NaOH 调节pH 至使溴酚蓝呈蓝色。
四、结果分析
1. 1D SDS-PAGE用免疫沉淀后的样品可直接进行一维凝胶电泳，或者对磁珠上的蛋白A 或蛋白G 进行耦联剂修饰，洗脱后的样品可进行Western Blot。
2. RIPA裂解液：
1. 1D SDS-PAGE用免疫沉淀后的样品可直接进行一维凝胶电泳，或者对磁珠上的蛋白A 或蛋白G 进行耦联剂修饰，洗脱后的样品可进行Western Blot。
2. RIPA裂解液：
150 mmol/L NaCl；1.0%NP-40；0.5%脱氧胆酸钠； 0.1%SDS ；50 mmol/L Tris（ pH8.0）。
注意事项
为了避免抗体的共洗脱，在继续进行免疫沉淀之前，应该将抗体交联到免疫磁珠,建议使用交联剂。
常见问题
Dynabeads protein A 捕获的 Ig 量取决于起始样品中 Ig 的浓度。 100 µl Dynabeads A 蛋白可从含有 20- 200 µg IgG ⁄ml 的样品中分离约 25- 30 µg 人 IgG。 绝大部分位点与 Fc 结合，实现最优的 Ig 取向。
来源：丁香实验
