分光光度法（分光光度法测定叶绿素含量）

叶绿素广泛存在于果蔬等绿色植物组织中，并在植物细胞中与蛋白质结合成叶绿体。当植物细胞死亡后，叶绿素即游离出来，游离叶绿素很不稳定，对光、热较敏感；在酸性条件下叶绿素生成绿褐色的脱镁叶绿素，在稀碱液中可水解成鲜绿色的叶绿酸盐以及叶绿醇和甲醇。高等植物中叶绿素有两种：叶绿素a 和b，两者均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。

叶绿素的含量测定方法有多种，其中主要有：

1.原子吸收光谱法：通过测定镁元素的含量，进而间接计算叶绿素的含量。

2.分光光度法：利用分光光度计测定叶绿素提取液在最大吸收波长下的吸光值，即可用朗伯—比尔定律计算出提取液中各色素的含量。

叶绿素a 和叶绿素b 在645nm 和663nm 处有最大吸收，且两吸收曲线相交于652nm 处。因此测定提取液在645nm、663nm、652nm 波长下的吸光值，并根据经验公式可分别计算出叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的含量。

植物材料
96％乙醇 丙酮 石英砂 碳酸钙粉
分光光度计 电子顶载天平 研钵 棕色容量瓶 定量滤纸 吸水纸 擦境纸 滴管 漏斗

1.取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，去除中脉剪碎。称取剪碎的新鲜样品2g，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及3mL95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10mL，继续研磨至组织变白。静置3——5min。

2.取滤纸1张置于漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗，滤液流至100mL 棕色容量瓶中；用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。

3.用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至100mL，摇匀。

4.取叶绿体色素提取液在波长665nm、645nm 和652nm 下测定吸光度，以95％乙醇为空白对照。

1.光对叶绿素有破坏作用，实验操作应在弱光下进行，且应尽量在短时间内研磨。

2.色素提取液若混有其他物质而造成浑浊，将影响吸光度的测定，应重新过滤或离心。

3.色素吸光度测定前，应按仪器说明及标准叶绿素 a 、 b 对分光光度计的波长进行校正，否则影响叶绿素含量的测定精度。

1.无水乙醇提取时间较长且对某些材料特别是木本植物的叶绿素提取不够完全。无水丙酮提取会出现浑浊现象，影响比色测定。因此选用丙酮和无水乙醇混合提取叶绿素的效果较好，比列以2：1效果较佳。

2.传统的80%丙酮法由于含水量过高，造成叶绿素稳定性差，提取速度慢，测定值偏低，应慎重采用。