原理
材料与仪器
胰蛋白酶 胎牛血清 GIMSA染液 PBS 纯甲醇
培养皿 培养箱 显微镜
步骤
2. 完全培养基重悬,适当稀释后活细胞计数,调整细胞密度至1×103/ml。
3. 取0.5ml细胞悬液(即500个细胞),加入培养基,使体积达到9.4ml,37℃孵育。
4. 底层琼脂的制备。5%琼脂置沸水浴中,使之完全融化,取出1ml移人无菌小烧杯中,待冷却到50℃时,迅速加入9ml预温37℃的完全培养基,混匀后立即取0.8ml浇注24孔板,室温凝固。
5. 上层琼脂的制备。步骤3中预温的9.4ml细胞悬液中加入0.6ml 50℃的5%琼脂,迅速混匀,立即取0.8ml浇入24孔板,置室温凝固。每孔即含有40个细胞,一般每个实验组重复3个样本。
6. 常规培养2——3周。
7. 将培养板置于显微镜下计数克隆数,每个细胞集落含50个或大于50个细胞为1个克隆,以公式集落数=n孔中细胞集落数总和/n,克隆形成率=集落数/接种细胞数x100%计算克隆形成率,最后拍照。
8. 统计学分析。根据集落数和克隆形成率进行t检验,分析不同组别之间的差异。
注意事项
1. 取对数生长期的细胞,0.25%胰酶消化,离心收集细胞沉淀。
2. 完全培养基重悬,适当稀释后活细胞计数,调整细胞密度至1×103/ml。
3. 取0.5ml细胞悬液(即500个细胞),加入培养基,使体积达到9.4ml,37℃孵育。
4. 底层琼脂的制备。5%琼脂置沸水浴中,使之完全融化,取出1ml移人无菌小烧杯中,待冷却到50℃时,迅速加入9ml预温37℃的完全培养基,混匀后立即取0.8ml浇注24孔板,室温凝固。
5. 上层琼脂的制备。步骤3中预温的9.4ml细胞悬液中加入0.6ml 50℃的5%琼脂,迅速混匀,立即取0.8ml浇入24孔板,置室温凝固。每孔即含有40个细胞,一般每个实验组重复3个样本。
6. 常规培养2——3周。
7. 将培养板置于显微镜下计数克隆数,每个细胞集落含50个或大于50个细胞为1个克隆,以公式集落数=n孔中细胞集落数总和/n,克隆形成率=集落数/接种细胞数x100%计算克隆形成率,最后拍照。
8. 统计学分析。根据集落数和克隆形成率进行t检验,分析不同组别之间的差异。
常见问题
2. 在将细胞悬液和琼脂混合的时候,一定要把握好琼脂的温度,太高时,容易引起部分细胞死亡,太低则容易使局部结块。
3. 关于选择接种多少细胞的问题,24孔板一个孔,30——50个细胞已足够。太少,结果不准确;太多,计数太麻烦。当然,这还要根据细胞增殖能力或者说恶性程度来决定。当细胞增殖能力非常强时,可选择少接种一些细胞;当细胞增殖能力很弱时,可增加细胞接种数。
4.来源《分子生物学实用实验技术》。
来源:丁香实验