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软琼脂克隆形成实验

相关实验:软琼脂克隆形成实验

最新修订时间:

原理

软琼脂克隆形成实验主要用于非贴壁生长的细胞,某些细胞(如正常成纤维细胞)在悬浮状态下不能增殖,不适用此法。某些恶性肿瘤细胞,不仅在贴壁状态下能增殖,在悬浮状态下也能增殖,其在软琼脂中形成克隆的能力反映了其恶性程度。

材料与仪器

细胞样品
胰蛋白酶 胎牛血清 GIMSA染液 PBS 纯甲醇
培养皿 培养箱 显微镜

步骤

1. 取对数生长期的细胞,0.25%胰酶消化,离心收集细胞沉淀。


2. 完全培养基重悬,适当稀释后活细胞计数,调整细胞密度至1×103/ml。


3. 取0.5ml细胞悬液(即500个细胞),加入培养基,使体积达到9.4ml,37℃孵育。


4. 底层琼脂的制备。5%琼脂置沸水浴中,使之完全融化,取出1ml移人无菌小烧杯中,待冷却到50℃时,迅速加入9ml预温37℃的完全培养基,混匀后立即取0.8ml浇注24孔板,室温凝固。


5. 上层琼脂的制备。步骤3中预温的9.4ml细胞悬液中加入0.6ml 50℃的5%琼脂,迅速混匀,立即取0.8ml浇入24孔板,置室温凝固。每孔即含有40个细胞,一般每个实验组重复3个样本。


6. 常规培养2——3周。


7. 将培养板置于显微镜下计数克隆数,每个细胞集落含50个或大于50个细胞为1个克隆,以公式集落数=n孔中细胞集落数总和/n,克隆形成率=集落数/接种细胞数x100%计算克隆形成率,最后拍照。


8. 统计学分析。根据集落数和克隆形成率进行t检验,分析不同组别之间的差异。

注意事项

1. 取对数生长期的细胞,0.25%胰酶消化,离心收集细胞沉淀。


2. 完全培养基重悬,适当稀释后活细胞计数,调整细胞密度至1×103/ml。


3. 取0.5ml细胞悬液(即500个细胞),加入培养基,使体积达到9.4ml,37℃孵育。


4. 底层琼脂的制备。5%琼脂置沸水浴中,使之完全融化,取出1ml移人无菌小烧杯中,待冷却到50℃时,迅速加入9ml预温37℃的完全培养基,混匀后立即取0.8ml浇注24孔板,室温凝固。


5. 上层琼脂的制备。步骤3中预温的9.4ml细胞悬液中加入0.6ml 50℃的5%琼脂,迅速混匀,立即取0.8ml浇入24孔板,置室温凝固。每孔即含有40个细胞,一般每个实验组重复3个样本。


6. 常规培养2——3周。


7. 将培养板置于显微镜下计数克隆数,每个细胞集落含50个或大于50个细胞为1个克隆,以公式集落数=n孔中细胞集落数总和/n,克隆形成率=集落数/接种细胞数x100%计算克隆形成率,最后拍照。


8. 统计学分析。根据集落数和克隆形成率进行t检验,分析不同组别之间的差异。

常见问题

1. 在进行软琼脂克隆形成实验时,首先细胞计数要准确,可以重复计数,取平均值。其次在实验的操作过程中,很多步骤可能会引起污染,这个问题一定要注意。


2. 在将细胞悬液和琼脂混合的时候,一定要把握好琼脂的温度,太高时,容易引起部分细胞死亡,太低则容易使局部结块。


3. 关于选择接种多少细胞的问题,24孔板一个孔,30——50个细胞已足够。太少,结果不准确;太多,计数太麻烦。当然,这还要根据细胞增殖能力或者说恶性程度来决定。当细胞增殖能力非常强时,可选择少接种一些细胞;当细胞增殖能力很弱时,可增加细胞接种数。

4.来源《分子生物学实用实验技术》。

来源:丁香实验

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