平板细胞克隆形成试验

克隆形成试验是测定细胞增殖能力的有效方法之一，贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。细胞克隆形成率表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量，可以反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。

器材：

GIMSA 染液培养皿、培养箱、显微镜

试剂：

细胞样品胰蛋白酶、胎牛血清

DMEM 培养液、PBS、多聚甲醛

（1） 取对数生长期的各组细胞，分别用 0.25% 胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在 10% 胎牛血清的 DMEM 培养液中备用。

（2） 将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿 50、100、200 个细胞的梯度密度分别接种含 10 mL 37℃ 预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置 37 ℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养 2~3 周。

（3） 经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用 PBS 小心浸洗 2 次。加 4% 多聚甲醛固定细胞 5 mL 固定 15 分钟。然后去固定液，加适量 GIMSA 应用染色液染10~30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。

（4） 将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于 10 个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。

（1） 试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。

（2） 细胞在进行克隆形成实验时要求有 95% 以上的分散度，否则结果的准确度会受到很大影响。

（1） 克隆形成率公式：克隆形成率 = （克隆数/接种细胞数） × 100% ，细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。

（2） 一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。