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简介
荧光共振能量转移(FRET)
原理
作为一种高效的光学「分子尺」,荧光共振能量转移技术(fluorescence resonance energy transfer,FRET)是采用物理方法去检测分子间的相互作用的方法,是指两个荧光发色基团在足够靠近时,当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态,在该电子回到基态前通过偶极子相互作用,实现了能量向邻近的受体分子转移,即发生能量共振转移。
FRET 程度与基团质检的空间距离紧密相关,一般为 7~10 nm 时即可发生 FRET;随着距离延长,FRET 呈显著减弱。基团之间 FRET 的效率,可以由 E = 1/1 +(R/R0)exp6 反映,其中 R 表示基团之间的距离,R0 表示福氏半径,依赖荧光基团发射谱和淬灭基团激发谱的重叠程度,以及基团能量转移的偶极子的相对方位。
来源:
操作方法
以荧光物质 CFP(供体)-YFP(受体)为例,检测 AB 蛋白在细胞内的相互作用。1、细胞转染:构建质粒载体 CFP-A 和 YFP-B,将检测的 AB 蛋白分别偶联上荧光蛋白 CFP 和 YFP,并将两个质粒共转染到培养的细胞内;2、转染 24 小时后,去除培养基,并用 4% 的多聚甲醛固定细胞 15 分钟,用 PBS 洗涤两次;3、FRET 图像采集:确定 FRET 配对的激发波长,蓝光被调