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一氧化氮合酶显示实验

实验分类:

细胞实验

别名:

nitxic oxide synthase,NOS

最新修订时间:

简介

目前,一氧化氮合酶显示实验主要有两种:一氧化氮合酶组化显示实验和一氧化氮合酶免疫组化显示实验。组化法是细胞中的左旋精氨酸和氧在一氧化氮合酶(nitxic oxide synthase,NOS)的作用下生成一氧化氮和瓜氨酸。还原型辅酶II(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,NADPH)是一氧化氮合酶的辅酶,可以将孵育液中的底物脱氢,然后将氢传递给硝基四氮唑蓝(NBT),使后者还原成蓝黑色沉淀。一氧化氮合酶按调控条件分为组构型(cNOS)和诱生型(iNOS)。前者按细胞类型又可分为神经元组构型(nNOS)和内皮细胞组构型(eNOS)。前述的组化方法不能区分上述 NOS 的具体分型,因此可以利用针对不同类型 NOS(nNOS、eNOS、iNOS)的特异性抗体,通过免疫组化方法进行显示。

原理

一氧化氮合酶组化显示实验的基本原理是细胞中的左旋精氨酸和氧在一氧化氮合酶(nitxic oxide synthase,NOS)的作用下生成一氧化氮和瓜氨酸。还原型辅酶II(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,NADPH)是一氧化氮合酶的辅酶,可以将孵育液中的底物脱氢,然后将氢传递给硝基四氮唑蓝(NBT),使后者还原成蓝黑色沉淀,此即 NADPH 所在部位,也可代表 NOS 的所在部位。

    一氧化氮合酶免疫组化显示实验的基本原理是一氧化氮合酶按调控条件分为组构型(cNOS)和诱生型(iNOS)。前者按细胞类型又可分为神经元组构型(nNOS)和内皮细胞组构型(eNOS)。前述的组化方法不能区分上述 NOS 的具体分型,因此可以利用针对不同类型 NOS(nNOS、eNOS、iNOS)的特异性抗体,通过免疫组化方法进行显示。


来源:丁香实验团队

操作方法

一氧化氮合酶组化显示法

细胞中的左旋精氨酸和氧在一氧化氮合酶(nitxic oxide synthase,NOS)的作用下生成一氧化氮和瓜氨酸。还原型辅酶II(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,NADPH)是一氧化氮合酶的辅酶,可以将孵育液中的底物脱氢,然后将氢传递给硝基四氮唑蓝(NBT),使后者还原成蓝黑色沉淀。

一氧化氮合酶免疫组化显示实验

目前免疫组化多选用 SABC 法。一抗是特异性的针对检测蛋白的单克隆或多克隆抗体(本实验为兔抗大鼠 iNOS )。二抗是生物素标记的针对一抗的抗体(本实验为羊抗兔 IgG )。三抗是针对生物素的链霉亲和素-过氧化物酶复合物(streptavidin biotin complex,SABC)。这样就可以通过逐级放大的方式,以过氧化物酶标记要检测的蛋白(iNOS)。显色液为二氨基联苯胺(DAB)和双氧