异构酶的测定实验

生物化学实验

最新修订时间：2022-02-10

简介

葡萄糖异构酶是应用最多的酶之一，本质上它是木糖异构酶而非葡萄糖异构酶。它从各种各样的微生物中分离得来，它在微生物体内作为木糖代谢物。半纤维素，像木聚糖或阿拉伯糖，是最丰富的自然营养物质之一，包含了世界上大约 40％的生物量。它由木聚糖酶裂解，木聚糖酶是由生物体分泌到基质中的外泌酶，能使多聚结构分裂成单糖单位像木糖，单糖单位可被细胞重新吸收并被木糖异构酶转化成木酮糖，木酮糖激酶通过激活 D-木酮糖-5-磷酸使木酮糖进入磷酸戊糖途径。由于结构相似，葡萄糖可以被相同的酶异构成果糖，但效率比较低（转化因子大约是 5，取决于微生物各自的酶）。这个酶是一个同源四聚体，单个亚基的相对分子质量约为 45 000，而天然酶则接近于 200 000，每个亚基都有两个必要的二价金属离子，一个与催化反应直接相关。另一个用来维持天然结构。Mn^2＋是对木糖酶最有效用的离子，而对于葡萄糖反应有 Co^2＋会更有活性。在失去催化活性时，金属离子能可逆地与 EDTA 结合，这种酶相当稳定即使来源嗜温菌的酶也能在 50℃ 进行测定。

来源：《酶学实验手册》

来源：丁香实验

操作方法

D-木糖异构酶测定

实验所需「试剂」具体见「其他」20 ul 的实验混合物和 20 ul 酶溶液（各自用 20 ul TES 缓冲液作对照）混合，并在测定温度（例 50℃）下紧靠反应容器放置 15 min，在用冰冷却并加入 40 ul 半胱氨酸和 40 ul 咔唑溶液的情况下酶反应会停止，加入 1.2 ml 70％硫酸颜色开始变化，在室温下放置 10 min 后对比参照，在 546 nm 处测吸光值。

D-木糖异构酶微板分析

实验所需「试剂」具体见「其他」20 ul 的实验混合物和 20 ul 酶溶液（各自用 20 ul TES 缓冲液作对照）用 96 孔微板 50℃ 放置 15 min，15 min 后加入 0.15 ml 事先按 1:1 混合好的溶液 A 和溶液 B，然后将板在 80℃ 放置 40 min，用微孔板读数仪测 630 nm 处测吸光值。

葡萄糖异构酶的测定实验

实验所需「试剂」具体见「其他」实验步骤与木糖异构酶基本相同，唯一不同的是在酶反应以及加完半胱氨酸后，咔唑和硫酸混合物可以放置 30 min 进行颜色反应，并且在 560 nm 处测吸光值，用 D-果糖准备校对曲线。

葡萄糖异构酶微板测定

实验所需「试剂」具体见「其他」测定步骤与木糖苷基本相同，唯一不同的是在 490 nm 处测定吸光值。