核酸亲和层析法纯化蛋白质实验

蛋白质实验

最新修订时间：2022-02-10

简介

核酸亲和柱的应用极大地促进了核酸结合调节蛋白特性的研究，这些蛋白质涉及基因表达、染色体修复和复制、基因重组等的调控。核酸结合蛋白可以结合单链 DNA、双链 DNA 或 RNA。DNA 结合蛋白结合 DNA 可以是序列特异的，也可以是非特异的。此外，含有特异寡核苷酸的亲和树脂能用于某些酶的分离，这些酶利用结构非常相似的辅酶，如 NAD 和 NADP。总之，核酸亲和柱在各种蛋白质的纯化和特性研究中是一个有用的工具。

来源：《蛋白质技术手册》

来源：丁香实验

操作方法

步骤一　偶联寡核苷酸到溴化氰活化的 Sepharose 4B

1. 混悬 1.5 g CNBr-Sepharose 4B 在水中，室温静置 30 min 约可获得 5 ml 溶胀的胶。经烧结玻璃漏斗过滤，当水分滤尽而溶胀的胶仍是潮湿的时候，立即停止抽滤；2. 胶在漏斗内，依次用 4℃，200 ml mmol/L HCl、200 ml 水和 200 ml 10 mmol/L，pH 8.0 磷酸钾缓冲液清洗；3. 将胶移入含 2 ml 10 mmol/L，pH

步骤二　核酸亲和层析

在上样品液到核酸亲和柱之前，建议首先采用其他的纯化方法，如硫酸铵沉淀、离子交换或凝胶过滤层析等富集目的蛋白。这样可以除去绝大多数的污染物，并减少非特异结合。亲和层析柱一般来讲是短而粗的，例如长宽比为 2：1。1. 10 倍柱体积的平衡缓冲液（20 mmol/L，pH 8.0 Tris-HCl，0.15 mol/L KCl，1 mol/L EDTA）平衡柱；2. 调整样品液到相似的离子浓度（即 0.