酶法检测磷酸化实验

实验分类：

蛋白质实验

最新修订时间：2022-02-10

简介

对可逆蛋白质磷酸化在调节植物和动物细胞生理过程中起重要作用的认识正不断加深，许多技术都能用于揭示共价结合于蛋白质的磷酸基的存在。用 ³²P 代谢标记细胞随后分离 ³²P 标记蛋白质是揭示蛋白质磷酸化的最直接方法。

内容来源于《精编分子生物学实验指南（第五版）》

来源：丁香实验

操作方法

基本方案1 非特异酸性磷酸酶消化磷酸蛋白质

1. 制备含 100～200 μg 总蛋白的样品。通过透析或脱盐除去抑制性的代谢产物，或用 2 或 3 倍体积 50 mmol/L PIPES 缓冲液 pH 6.0，洗涤除去微粒物质。2. 样品在 100 μl PIPES/2－ME 或 PIPES /DDT 缓冲液，pH 6.0 中 30℃ 温育 10 min。3. 加入 5～10 U 马铃薯酸性磷酸酶，30℃ 温育 15 min。4. 取出 1

基本方案2 丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶消化磷酸蛋白质

1. 100 μg 总蛋白溶于 100 μl Tris／DTT／MnCl2 缓冲液 pH 7.5，对照反应加 1 μl Microcystin-LR。37℃ 温育 10 min。Microcystin－LR 是 PP1 和 PP2A 的有效抑制剂。2. 加入 0. 2～0. 5 U PP2A，37℃ 温育 10～30 min。1 U PP2A 或 PP1 在 30℃，pH 7.5，1 min 可水