原理
蛋白质磷酸酶和上面讨论的普通磷酸酶不同，它可在磷酸蛋白质底物的不同位点选择性脱磷酸化，因而可用于研究与蛋白质键合的特定磷酸基的功能性作用。
材料与仪器
含 100 μg 总蛋白的样品
50 mmol／L Tris • Cl缓冲液 ／ 1 mmol／L 二硫苏糖醇(DTT)缓冲液 ／ 1 mmol／L MnCl2缓冲液(现配现用) Microcystin－LR 蛋白质磷酸酶 2A(PP2A)
50 mmol／L Tris • Cl缓冲液 ／ 1 mmol／L 二硫苏糖醇(DTT)缓冲液 ／ 1 mmol／L MnCl2缓冲液(现配现用) Microcystin－LR 蛋白质磷酸酶 2A(PP2A)
步骤
1. 100 μg 总蛋白溶于 100 μl Tris／DTT／MnCl2 缓冲液 pH 7.5，对照反应加 1 μl Microcystin-LR。37℃ 温育 10 min。
Microcystin－LR 是 PP1 和 PP2A 的有效抑制剂。
2. 加入 0. 2～0. 5 U PP2A，37℃ 温育 10～30 min。
1 U PP2A 或 PP1 在 30℃，pH 7.5，1 min 可水解 1 nmol 磷酸化酶 A。
3. 加入 Microcystin－LR 至终浓度 1 μmol／L 终止脱磷酸反应。
4. 用 SDS－PAGE 分析脱磷酸物或进行功能测定（见基本方案 1）。
来源：丁香实验
