PCR在临床诊断及流行病调查中的应用

根据实验方法的不同，对应的原理也有所不同：

 

表位特异PCR在临床诊断及流行病调查中的应用的基本原理是需要发现某个病原体的特异表位，再找出该特异表位相对应的DNA序列，然后就可用常规PCR方法把编码特异表位的DNA扩增出来而达到对某病原体的诊断。

双标记PCR在临床诊断及流行病调查中的应用的基本原理是先将待检病原菌相关的单克隆抗体标记在胶体金颗粒上制成免疫胶体金试剂，通过特异性抗体的免疫反应将待检病原菌吸附在胶体金颗粒上，然后提取病原菌的DNA,通过PCR反应来实现遗传物质的进一步放大。PCR 的基本原理和操作方法与常规PCR类似，不同之处仅在于用生物素和地高辛分别标记PCR的上下游引物，因此扩增产物也带有双标记，可进行免疫学检测，从而可以快速、灵敏和准确地检测食品中污染的病原菌。

降落PCR在临床诊断及流行病调查中的应用的基本原理是每一个(或n个)循环降低1 °C (或n °C)退火温度，直至达到一-个较低的退火温度，这个温度称为“touchdown"退火温度，然后以此退火温度进行10个左右的循环。

 

据统计，正确和非正确退火温度之间的1 °C差异将造成PCR产物量的4倍差异，如果相差5 ℃，就会产生45(1024) 倍的优势，因此相对于非正确产物，正确的产物可以得到富集。退火温度起始在高于计算的Tm值的15C左右，在接下来的循环中，退火温度以每次1~2 ℃逐渐降低，直到Tm值以下5 ℃,当达到特异的引物模板结合的Tm值时，扩增就会开始。

 

当退火温度降到非特异扩增发生的水平时，特异产物会有一个几何级数的起始优势，在剩余反应中，特异产物优先扩增，从而产生单一的占主导地位的扩增产物。这种方法主要用于避免非特异PCR产物的出现，尤其是当使用复杂的基因组DNA模板，非特异的退火更容易发生时。

 

降落PCR中正确的产物得到富集，原理在于温度的升高提高了PCR扩增的特异性，但也提高了引物结合的难度，降低了扩增的效率，因此一开始先用高温扩增，保证扩增的严紧性，待目的基因的丰度上升后，降低扩增的温度，提高扩增的效率(此时非特异的位点由于丰度低，无法和特异位点竞争)。

 

但是，降落PCR无法改善扩增效率低的问题，-般用于在杂模板中提高扩增特异性。

16 SrRNA PCR在临床诊断及流行病调查中的应用的基本原理是细菌的核糖体RNA (rRNA)按沉降系数分为5S、16S 和23S,其编码基因(rDNA) 长度依次为120个、1540个及3300个核苷酸。

 

典型的原核生物大肠杆菌核糖体是由50S大亚基和30S小亚基组成的。在完整的核糖体中，rRNA约占2/3,蛋白质约为1/3。50S大亚基含有34种不同的蛋白质和两种RNA分子，相对分子质量大的rRNA的沉降系数为23S,相对分子质量小的rRNA为5S。

 

30S小亚基含有21种蛋白质和一一个16S的rRNA分子。rRNA基因由保守区和可变区组成，在细菌中高度保守。rRNA基因包含5'端到3'端的若干种成分，分别是16S rDNA、间区、23SrDNA、间区和5SrDNA。16SrDNA基因是细菌染色体上编码16SrRNA相对应的DNA序列，它集保守性和变异性于一身，存在于所有细菌的染色体基因组中。

 

PCR偶联连接酶链式反应在临床诊断及流行病调查中的应用的基本原理是通过常规PCR扩增待检基因，用设计的简并引物与该基因进行复性，通过连接酶将匹配分子连接在一起的反应。

快速PCR在临床诊断及流行病调查中的应用的基本原理是与常规PCR相同，不同之处在于缩短每个步骤所需时间和温度转换时间，
提高PCR聚合酶的延伸活性、延伸速率必将缩短整个PCR反应所需时间。

稀有限制性位点PCR在临床诊断及流行病调查中的应用的基本原理是模板是用两种限制性内切酶消化的基因组DNA,一种限制性内切酶在基因组中具有稀少的酶切位点(例如XbaI，其识别序列为T/CTAGA),另一种限制性内切酶在基因组中酶切位点较多(例如HhaI，其识别序列为GCG/C)。

 

基因组消化的过程见图12-17(a)①。用两种酶消化的基因组DNA产生了具有黏性末端的限制性片段，在这些黏性末端通过连接反应连接上双链接头AX和AH。接头(AX和AH)和引物(AH1、 PX、PX-G、 PXC、PX-T、 PX-A) 的组成和序列见表12-3。连接的过程见图12-17(a)②。

 

两种接头都是由长短两个寡核苷酸链组成，在较低的温度退火结合在一起形成双链，结合在--起的双链可以有效地进行连接反应;在较高的温度下长短两个寡核苷酸也可以变性分离形成单链。短寡核苷酸链(AH2 或AX2)连接到限制性片段上后，将无法再参与PCR。只有长寡核苷酸链(AH1或AX1)参与PCR。在HhaI接头AH中长寡核苷酸链AH1连接到HhaI酶切产生的限制性片段5'凹陷端。

 

Xba I接头AX中的长寡核苷酸链AX1磷酸化后连接到XbaI酶切产生的限制性片段3'凹陷端，而AX中的短寡核苷酸链AX2没有磷酸化，所以AX2不参与连接。连接好的片段就可以作为模板进行PCR了。在PCR反应中，只有少数连接有XbaI接头的片段才可与引物PX结合。

 

由PX引物进行的单链延伸也就产生了引物AH1的结合序列，这样就可特异性地扩增XbaI -HhaI片段。PCR扩增的整个过程见图12-17(a) ③~⑥。两端只有Hha I位点的片段是不能扩增的，因为不会产生AH1引物的结合序列。不扩增的原理见图12-17(b)。

 

需要指出的是，引物PX是接头寡核苷酸AX1的反向互补序列并在3'端另加一-碱基A得到的。在3’端加一-碱基A的目的是防止引物PX与在连接反应中可能形成的接头引物二聚体的结合。

 

为了增加PCR的特异性，可以合成另外4种引物(PX-G、 PX-C、PX-T、PX-A)， 每一种引物均在3'端分别再加一一个碱基(G、C、T、A)。这样，每一种引物都可特异性地扩增出Xba I -Hha I片段混合物中的特异片段，此特异片段根据XbaI位点下一个碱基的不同而不同，图解示意见图12-17。