昆虫杆状病毒表达系统的建立

实验分类：

DNA 实验

别名：

Bac-to-Bac系统

最新修订时间：2022-02-10

简介

杆状病毒是双链DNA病毒，主要感染昆虫，也感染体外昆虫细胞系，对人畜无毒害。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）是目前宿主最广、应用最多的杆状病毒。

它与草地贪夜蛾Sf21细胞系建立了广为应用的Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，该系统表达的外源基因，表达量多，能进行产物加工、修饰和折叠，形成有生物活性的产物。

是当今基因工程领域中的四大表达系统之一，已表达上千种外源基因。

原理

Bac-to-Bac系统的技术原理是该系统主要包括供体质粒pFastBac，大肠杆菌DH5a、DH10Bac，昆虫Sf21细胞等。

供体质粒pFastBac上有Tn7的左右臂序列，两臂之间是病毒多角体基因 polyhedrin的强启动子及其下游的多克隆位点、polyA位点，庆大霉素抗性基因等。

将外源基因连接到供体质粒上，转化DH5a感受态细胞，提取重组供体质粒，再转化DH10Bac感受态细胞，该细胞含有穿梭质粒Bacmid和辅助质粒 helper，Bacmid上有F复制子，卡那霉素抗性基因及 lacZa肽段编码基因，LacZa基因上有细菌转座子Tn7的附着位点 mini-attTn7。

重组供体质粒的Tn7在DH10Bac中 helper编码的转座酶帮助下转座到Bacmid上的 mini-attTn7位点，干扰了LacZ的表达，因此具有重组 Bacmid的DH10Bac在庆大霉素、卡那霉素、四环素（辅助质粒对四环素有抗性），及含有X-gal、IPTG的培养板上形成白色菌落。

提取重组Bacmid，脂质体法转染昆虫Sf21细胞，在培养液中可获得重组病毒，重组病毒可继续感染昆虫细胞，外源基因随着病毒扩增而表达。

供体质粒pFastBacDUAL有两个克隆位点，一个位于poly-hedrin的启动子下游，一个位于p10启动子下游。

用它构的重组病毒感染细胞后表达两种蛋白，有的学者把绿色荧光蛋白基因构建到p10启动子下游，表达的绿色荧光作为标记蛋白。

来源：丁香实验团队

操作方法

杆状病毒表达系统的建立

杆状病毒是双链 DNA 病毒，主要感染昆虫，也感染体外昆虫细胞系，对人畜无毒害。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）是目前宿主最广、应用最多的杆状病毒，它与草地贪夜蛾 Sf21 细胞系建立了广为应用的 Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统。该系统表达的外源基因，表达量多，能进行产物加工、修饰和折叠，形成有生物活性的产物，是当今基因工程领域中的四大表达系统之一，已表达上千种外源基因。