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简介
来源:丁香实验
操作方法
1. 按5×105细胞/孔的量在六孔板中接种指数期生长的细胞,在37℃ 5%CO2培养箱中 培养过夜,直至细胞80%汇片。(如果用100 mm 培养皿代替六孔扳,则培养细胞至80%汇片,将所有数量扩大8倍) 2. 在聚苯乙烯管中配制DNA/脂质体复合物如下:稀释质粒DNA至1 ml DMEM-SF中,在旋涡混合器上振荡1 s 然后加入脂质体悬液、再次旋起混匀。在室温下温育5~ 10 mi
脂质体进行稳定转染1. 接种细胞(见“脂质体介导短暂表达”步骤1)长至50%汇片。 2. 制备DNA/脂质体混合物,转染细胞(见“脂质体介导短暂表达”步骤2和3)。 3. 每孔细胞加入1 ml DMEM-20完全培养液,37℃ 培养箱培养48 h。 4. 吸去DMEM,稀释细胞分传于选择培养液中。将细胞培养适当时间以选择真正被转染的细胞克隆。
哺乳动物细胞的选择标记一、腺苷脱氨酶(ADA) 1. 选择条件:培养液中加10 μg/ml胸腺嘧啶脱氧核苷,15 μg/ml次黄嘌呤,4 μmol/l 腺嘌呤-9-β-D-呋喃木糖苷(Xyl-A),及0.01~0.3 μmol/l 2‘-脱氧助间型霉索(dCF)。胎牛血清中含有ADA可解除培养液的毒性,所以在用前才加入培养液中。 2. 选择原理:Xyl-A可转化成Xyl-ATP并掺入核酸中,从而导致
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