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脂质体介导的细胞转染实验

互联网2013-11-13

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实验原理

外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。
利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。

本次实验采用的脂质体是promega公司的TransFast脂质体试剂，它是一种阳离子脂质体和中性脂质体的混合物，是对于本次实验中采用的293T细胞优化的转染试剂。

实验试剂

1. DMEM培养基
2. 链霉素/青霉素（双抗）
3. FCS（小牛血清）
4. PBS（磷酸盐缓冲溶液）
5. 胰酶/EDTA消化液
6. 转染试剂（TransFast）

实验设备

1. 20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip头
2. 酒精灯
3. 废液缸
4. 血球计数板
5. 涡旋振荡器
6. 恒温水浴箱
7. 台式离心机
8. 35mm培养皿
9. 转染管
10. 15ml离心管
11. 观察用倒置显微镜
12. 荧光显微镜和CCD

实验材料

1. 293T细胞
2. MyoD表达质粒和EGFP表达质粒

实验步骤

1. 细胞传代
1) 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。
2) 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。
3) 用Tip头加入1mlTrypsin液，消化1分钟（37℃，5%CO₂ )。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。
4) 加入1ml的含血清培养基终止反应。
5) 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。
6) 将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。
7) 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X10⁶ 个细胞加入一个35mm培养皿。
8) 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。
9) 将培养皿转入CO₂ 培养箱中培养，第二天转染。
2. 细胞转染
1) 转染试剂的准备
a. 将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。
b. 震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡，。
2) 选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。
3) 将混合液在室温放置10—15分钟。
4) 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。
5) 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。
6) 到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。
3. 第二次细胞传代
1) 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。
2) 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X10⁵ 个细胞/35mm培养皿将细胞重新粉入培养皿中。
3) 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。

注意事项

1) 分裂细胞相比较非分裂细胞——分裂细胞往往要比静止细胞更易于摄取并表达外源DNA。因此对大多数转染操作而言，细胞都在转染当天或前一天种板。同样重要的是细胞在种板进行转染时不应处于过度生长的状态；此外，还常用促有丝分裂刺激物（如，病毒转化，生长因子，条件培养基，以及滋养细胞）来活化原代培养细胞。

2) 贴壁细胞相比较悬浮细胞——在转染效率方面贴壁细胞和悬浮细胞之间的差异显著。相对于贴壁细胞（如HEK，CHO），悬浮细胞（如HL 60，Jurkat）非常难以转染，可能是因为细胞间膜结构的差异，但目前还没有分子水平上合理机制的解释。

3) 分板方案——在对培养细胞进行分板传代培养之前，必须把贴壁细胞用胰蛋白酶消化使之脱离培养基质。这个常规操作可导致正常细胞功能受到严重损害。因此分批方案的不同（如，胰蛋白酶消化时间的长短，胰蛋白酶的灭活等）需要优化。

4) 传代次数——传代次数是指对一个细胞系进行分批传代的频度（通常在一个实验室范围内）。某些细胞系相比较其他细胞系而言较不稳定，可能会随着培养时间的延长而改变，视不同的细胞系和培养条件而定。因此名称相同的同一细胞系在生理学和形态学（以及转染能力）性质也可能会有很大的差异。一般而言，细胞在冻存复苏后的一两代之内或直到它们完全复苏之前都很难转染。

5) 细胞数量（融合率）——只要培养基质（组织培养皿）尚有空间，细胞就会按指数规律分裂。对于正常细胞而言，细胞生长的速度受细胞密度大小的抑制（接触抑制），但癌细胞则不受此限制而会继续生长并可互相叠加。营养物质的耗竭以及代谢废物的积聚会影响所有的细胞生长。细胞会因受到营养物质匮乏的压力而不适于转染。报告基因的表达率与转染开始时的细胞数量和细胞健康以及细胞溶解之前的生长情况相关。

6) 培养物污染——培养物可被细菌、酵母、真菌、病毒、支原体、甚至其他细胞种类所污染。各种污染都会导致产生错误的结果。

7) 支原体污染——支原体污染在所有培养细胞中的比例为5-35%，它可改变细胞生长特性，酶的作用途径，细胞膜的组成，染色体结构，以及转染效率。特别是，支原体对采用脂质、DEAE-右旋糖酐、磷酸钙或腺病毒介导的转染技术有所干扰，其结果致使非典型转染或转染效率偏低。这些影响会导致实验结果的不可靠以及时间和珍贵细胞系的损失。和细菌及真菌不同，支原体污染无法通过视觉检查发现。它们非常小甚至能够通过大多数的无菌滤膜；它们还对常用抗生素有抗药性。所以必需进行支原体污染的常规筛查。

2. 交叉污染

如果同一个实验室同时培养不同种类的细胞，那就有可能发生交叉污染，即使遵循最严格的分离操作规程这种情况也有可能发生。如有许多细胞系被HeLa 细胞所污染。和其他细胞系之间的交叉污染不总是能通过镜检发现。如果有少量某种生长快速的细胞掺入到培养细胞种，几个月过后它们就会完全取代目标培养物。

一般原则：对纯化所得的载体进行质量鉴定。确定维持其正常功能的基因序列是否适合于您的细胞体系。在测定细胞体系的参数时，一定要选用一种已知具有功能的载体做对照。

1) 载体的完整性——载体是否具有功能取决于它结构的完整性。转染效率受到质粒制备物的超螺旋结构和舒展结构之间比例、双螺旋断裂、核酸酶的降解，以及来自于储存和处理过程中的物理压力的影响。

2) 载体制备物——各种载体是按照不同的方案在细菌体系中制备并纯化。制备产物中残余的污染物（如CsCl，内毒素）可能会影响转染效率。

3) 载体构造（启动子/增强子/ORI）—转染体系通常用带有强病毒调节元件（如，RSV，CMV，和SV40）的对照载体进行优化和比较。然而，病毒启动子/增强子体系的相对有效性在不同细胞系间的差异可大到两个数量级。例如，在某些细胞系中，由于自发的质粒扩增，SV40体系可高效表达large T抗原（如，COS）；而在其他许多细胞系中，则是CMV启动子更为有效。

除此之外，各种CMV载体的表达率也会有超过一个数量级的差异，这部分是由于载体中其他调节元件所引起的。

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