磷酸钙介导的细胞转染

磷酸钙介导的细胞转染

材料

试剂
2XBES缓 冲 生 理 盐 水 （BBS)(pH6.85〜7.20)

50m m o l / L B E S

I. 5m m o l / L N a 2H P O 4

280m m o l / L N a C l

调节缓冲液的pH , 选择至少三种PH 的缓冲液；使用刚校准而清洁的p H 计 。使用2XBBS工作液作为p H 参考来制备下一组的2XBBS缓冲液。将缓冲液过滤灭菌，密 封 于 5〇ml玻璃瓶中， 4° C保存。缓冲液可以保存I2 个月。

待 转 染 的 细 胞 系 （原 代 海 马 神 经 元 细 胞 ）

H BSS 清 洗 液 （ p H 7. 3)

135m m o l / L N a C l

20m m o l / L H E P E S

4m m o l / L K C l

l m m o l / L N a 2H P O 4

2m m o l / L C a C l2

l m m o l / L M g C l 2

10m m 〇 l/ L 葡 萄 糖 溶 液

调 节 p H 至 7 . 3 , 过滤灭菌， 4C 条件下可保存一年。

2.5m o l / L CaClz

从我们的经验来看，反 复 的 冻 融 2 XBBS缓 冲 液 和 CaClz 溶液会影响转染结果的重复性。因此，我们建议所有的溶液和缓冲液都保存在4℃

N M E M -B 2 7 转 染 培 养 基 （p H 7. 4)

向 MEM (Invitrogen) 中加人 lmmol/L 丙 酮 酸 钠 （Sigma-Aldrich)、 15mmol/L HEPES (Invitrogen)、 2mmol/L L-谷 氨 酸 （PromoCell) ， 1XB27 补 充 液 （Invitrogen) 和 33mmol/L I>
葡 萄 糖 （Sigma-Aldrich)。调 节 p H 至 7. 4 , 过滤灭菌，保 存 在 50m l密封的玻璃瓶中，有效期 2 个 月 。

质 粒 D N A

为了制备高纯度的质粒，使用不含内霉素的Maxi-prep试 剂 盒 （如 QIA G EN 不含内霉素的Maxi试剂盒）或 CsCl梯度法。 DNA的纯度通过测量OD值来评价， O IW O D 28。大 约 1.8为最佳。用 水 或 T E 缓冲液溶解质粒。使用前，质 粒 在 4T 离心。可以用两种质粒共转染，

通 常 ，当两种给定质粒的比例在1 : 1 时 ，共 转 染 的效率可达9 5 % (GoetzeetaL 2004)。一次使用三种或更多质粒转染比较困难，必须使用合适的标记物在单细胞水平谨慎地控制。

仪器

新近校准而洁净的P H 计 。

方法

1•准备待转染的细胞，将它们转移到含有2m l 转染液的玻璃培养皿中。

2•为了制备共沉淀，按顺序将下列物质转移的1.5m l 的离心管中：

6ul CaCl2

x ul H 2O (混合均匀）

3ug 质粒 D N A (缓慢的加人D N A ，同时用枪头充分搅拌混合）

总体积为6〇ul,不足部分用水补充。

3•滴加60ul的 2 X B B S 缓冲液到CaCl2/D N A 溶液。每加人3 滴后轻轻敲打离心管5次，使各组分充分混合。不要涡旋！

4 . 迅速将12〇ul的转染混合物加人到转染培养基中。与细胞在36. 5°C 、 5 % C O 2 的细胞培养箱中培养。

为了増加到达细胞表面的共沉淀物，当沉淀可用肉眼观察到时，将含有细胞的培养皿在室温， 1000r/min离心2〜6min。在随后的培养过程中，每 10〜15min观察一次细胞，因为细胞死亡率会随时间而迅速增加。细胞死亡的典型表现就是出现细胞溶胀和细胞核完整性的缺失。当采用离心这一步骤时，与没有离心的细胞相比，离心的细胞与沉淀物的共培养时间可以显著缩短，转染效率增加5 0 % (B. Goetze etal. 未发表)。

5.45mirx后或直到6h ，神经元细胞被精细的共沉淀物均匀覆盖，这 用 I O X 的物镜就可以清楚地观察到（ Goetze et al.2004)。

6•吸除转染培养液，替换成预热的H B S S 清洗液。 5m i n 后在显微镜下观察细胞，此时沉淀应该已经完全溶解。清洗细胞时间不要超过15m m 。

7•吸除H B S S 缓冲液以除去D N A /C a P 0 4 沉淀物，将细胞在正常培养基中培养。

8•用合适的方法检测蛋白质的表达（依据实验设计，可以采用报道基因表达的检测、染色和显微镜、免疫染色以及免疫印迹等方法） 。