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免疫组化,特征性如何,什么情况会出现假阳性?

相关实验:小鼠脑片免疫组织化学(ABC 法)实验

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dxy_f6seaw57

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毛利小五郎的徒弟

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1. 消除病理性色素的影响:
当所检动物由于出血等原因造成吞噬含铁血黄素细胞增多时,为防止其与 DAB 显色呈现的黄褐色发生混淆,优先选用AEC显色剂。组织固定时间过长时,切片中容易产生福尔马林色素颗粒,影响结果观察,取材时应充分用流水冲洗,以消除影响。
切片制作不当引起的非特异性着色 在严重变性、坏死及炎性病灶处,在胶原纤维和结缔组织部位,在切片裱贴不平、折皱处以及组织边缘部位常会出现非特异性着色。其中有的是因组织荷电状态改变而吸附抗体;有的机理不明;有的可能与组织边缘或皱折深部的槽形构型有关,解决的办法是在滴加一抗前,以二抗动物的正常血清( 5 %~10 %)封闭、饱和电荷吸附位点和改善取材与制片技术。

2. 清洗不充分而造成的非特异性着色:
应严格操作规程。缓冲液中含一定量的盐,其有利于减低背景着色,通常使用 0.05mlo/L PBS ,溶液内加入吐温 20 ,效果更佳。特殊标记时,试剂公司一般都提供缓冲液的配方。另外,在清洗后至加入下一步试剂前,不能干片,干片的部位会出现非特异着色。

3. 消除内源酶的影响:
在涉及免疫过氧化酶的各种染色中,均用过氧化物酶来标记抗体,酶的作用是催化底物,使显色剂显色,正常组织中也含有一定量的过氧化物酶,其同样也能催化底物显色,而影响免疫组化染色的特异性,因此在加入标记酶前应设法将其灭活,以保证染色反应的特异性。
通常情况下,去除内源酶的方法是先用 3%的过氧化氢溶液作用,但在含有丰富血细胞的标本中,由于血细胞中存在大量具有活性的过氧化物酶,能与过氧化氢产生强烈的反应,产生气泡而破坏组织结构和细胞形态。在 OCT 包埋的冰冻切片中,使用 3%的过氧化氢化溶液亦会产生类似现象。此时可用 3%的过氧化氢甲醇溶液孵育 20 分钟的方法灭活内源性酶。

4. 消除非特异性背景着色:
非特异性着色zui常见的情况是蛋白质(抗体)吸附到组织切片中高度荷电的胶原及结缔组织成分上,防止非特异性背景着色的方法之一是在滴加一抗前在标本上加一种无关的蛋白质溶液,封闭荷电点不给一抗留有吸附余地,以保证一抗不会吸附到胶原纤维及结缔组织成分上。zui常用的无关蛋白质溶液是所用二抗的同种动物非免疫血清。用产生二抗的同种动物血清,是为了避免二抗与预先加入的蛋白质结合引起假阳性染色。

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