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需要破膜,用适量体积的Flow Cytometry Staining Buffer重悬细胞,并上机检测并分析。注:由于染色过程中使用了细胞固定和破膜,对比起活细胞在形态上会有一定变化,因此FSC/SSC图中圈门时需要做一定调整。
毛利小五郎的徒弟
要1、在每个流式上样管中加入100 µl准备好的细胞悬液,细胞数约为1x106个.
2、按照细胞表面抗原染色方法标记表面抗原。根据说明书加入CD4和CD25抗体100 µl体系中使用0.125 µg FITC anti-mouse CD4,0.06 µg APC anti-mouse CD25抗体。最好根据这些试剂详细的说明书操作。4 ℃孵育30 分钟。孵育表面抗体之前加入Fc受体阻断剂。
3、用预冷流式染色缓冲溶液洗涤细胞(离心并转移)。
4、旋涡震荡重悬细胞后加入1ml的固定/破膜工作液(Fixation/Permeabilization)(1:3稀释好),并再次旋涡混匀。
5、避光4℃孵育30分钟到18小时(孵育30分钟到18小时,结果一样)。
6、加入2ml 破膜缓冲液(Permeabilization Buffer)(1:9去离子水稀释)离心洗涤细胞并弃去上清液。
7、重复第6步操作洗涤细胞。
8、(可选)加入含0.5 µg Fc受体阻断剂的破膜缓冲液,保证100 µl体系4 ℃孵育15分钟。
9、封闭液无需洗去,体系加入0.5 µg PE antimouse/rat Foxp3抗体和PE Rat lgG2a同型对照(用Permeabilization Buffer工作液进行稀释),避光4℃孵育至少30分钟。建议进行预实验摸索出抗体的最适浓度。
10、加入2ml破膜工作液离心洗涤细胞并弃去上清液。
11、重复上一步洗涤细胞。
用适量体积的Flow Cytometry Staining Buffer重悬细胞,并上机检测并分析。注:由于染色过程中使用了细胞固定和破膜,对比起活细胞在形态上会有一定变化,因此FSC/SSC图中圈门时需要做一定调整。
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