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小鼠th17/treg细胞怎么测?

相关实验:药物对动物腹腔巨噬细胞的影响实验

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yanlai000

小鼠th1/treg细胞怎么测,要破膜吗?

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需要破膜,用适量体积的Flow Cytometry Staining Buffer重悬细胞,并上机检测并分析。注:由于染色过程中使用了细胞固定和破膜,对比起活细胞在形态上会有一定变化,因此FSC/SSC图中圈门时需要做一定调整。

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土井挞克树

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1、在每个流式上样管中加入100 µl准备好的细胞悬液,细胞数约为1x106个.

2、按照细胞表面抗原染色方法标记表面抗原。根据说明书加入CD4和CD25抗体100 µl体系中使用0.125 µg FITC anti-mouse CD4,0.06 µg APC anti-mouse CD25抗体。最好根据这些试剂详细的说明书操作。4 ℃孵育30 分钟。孵育表面抗体之前加入Fc受体阻断剂。

3、用预冷流式染色缓冲溶液洗涤细胞(离心并转移)。

4、旋涡震荡重悬细胞后加入1ml的固定/破膜工作液(Fixation/Permeabilization)(1:3稀释好),并再次旋涡混匀。

5、避光4℃孵育30分钟到18小时(孵育30分钟到18小时,结果一样)。

6、加入2ml 破膜缓冲液(Permeabilization Buffer)(1:9去离子水稀释)离心洗涤细胞并弃去上清液。

7、重复第6步操作洗涤细胞。

8、(可选)加入含0.5 µg Fc受体阻断剂的破膜缓冲液,保证100 µl体系4 ℃孵育15分钟。

9、封闭液无需洗去,体系加入0.5 µg PE anti­mouse/rat Foxp3抗体和PE Rat lgG2a同型对照(用Permeabilization Buffer工作液进行稀释),避光4℃孵育至少30分钟。建议进行预实验摸索出抗体的最适浓度。

10、加入2ml破膜工作液离心洗涤细胞并弃去上清液。

11、重复上一步洗涤细胞。

用适量体积的Flow Cytometry Staining Buffer重悬细胞,并上机检测并分析。注:由于染色过程中使用了细胞固定和破膜,对比起活细胞在形态上会有一定变化,因此FSC/SSC图中圈门时需要做一定调整。

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