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为什么稳转Gaussia luciferase的细胞系检测不到RLU?

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Shan9

求助:我根据文献构建了表达Gluc的质粒(因其本身是分泌性的我去掉了信号肽),然后无论是稳转还是瞬转细胞裂解后加腔肠素底物数值都不高,跟不裂解的细胞差不多。文献中的结果都有几十万倍的差异,有没有有经验的老师同学指导一下可能是哪里出问题了呢?是没表达吗?还是我检测体系有问题?

我用的底物是MCE(HY-18743)无水乙醇稀释至1mM然后使用时用PBS稀释100倍

参考文献:Development and characterization of a novel luciferase based cytotoxicity assay.&Codon-Optimized Gaussia Luciferase cDNA for Mammalian Gene Expression in Culture and in Vivo

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3 个回答

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毛利小五郎的徒弟

有帮助

可能是转染后存在降解,一般降解发生的比较快,降解后就检测不到rlu了

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Shan9user-title

谢谢回复,但是就是因为Gluc比Fluc稳定才选择这个荧光素,文献中还传了好几代都没问题,我稳转第一次时间都检测不到,怀疑根本没表达了

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loveliufudan

有帮助

有几个可能的原因导致表达的Gluc酶活性较低:

1. 质粒构建问题:确保您的质粒构建正确,包括正确连接了Gluc基因,没有任何错误插入或删除。检查质粒序列是否与您预期的一致,并确保质粒在细胞中得到稳定复制和表达。

2. 转染效率问题:如果您使用的是瞬时转染,确保转染效率足够高,以确保足够的细胞表达Gluc。优化转染条件,如细胞密度、转染剂浓度和转染时间,可能会提高表达效率。

3. 细胞裂解条件:确保您的细胞裂解条件适当。不同的细胞类型和表达系统可能需要不同的裂解缓冲液和条件。优化细胞裂解条件,例如裂解缓冲液的pH、浓度和裂解时间,可能会提高腔肠素底物的检测灵敏度。

4. 底物浓度和稀释问题:检查您用于检测的底物浓度和稀释倍数是否适当。确保底物稀释倍数能够适当放大信号,并且不会造成信号饱和或过低。

5. 检测体系问题:确保您的检测体系条件正确。包括使用适当的缓冲液、温度和检测仪器设置。优化检测体系参数可能有助于提高灵敏度和准确性。


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Shan9user-title

你好,谢谢回复,请问

  1. 要如何确定质粒在细胞内稳定表达呢?我没有添加荧光标签,稳转后也用嘌呤霉素筛选过了。序列是从uniprot上下载的去掉了信号肽,我感觉最可能这一步出了问题,插入后不表达。
  2. 底物也不太确定,最好是能够有阳性对照,确定Gluc表达没有问题,这样就知道检测体系是否有问题了。


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sswei

有帮助

因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大,增值较慢,时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没,最终导致筛选不出阳性。

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Shan9user-title

感觉有道理哎,我虽然稳转时用puro筛了但是似乎没太有细胞死亡,然后没有GFP标签也没办法通过分选筛单克隆,可能混了不同表达强弱的细胞在里面?

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