clarasun
构了一套质粒,pcdh➕1个oe,plko➕3个sh,一共6个,带amp、gfp、puro。转293,一直是3个sh效率还可以(48h 70%),另外三个几乎转不上,每个孔只有几个细胞表达荧光。
质粒大小7-10k,浓度在200-500ng/ul,260/280和260/230都在正常范围。12孔板质粒1-3ug,脂质体2-5ul每孔,比例都梯度试过。293密度40-95%都试过。转染试剂用过pei/碧云天lipo8000/碧云天lipo293和翊圣脂质体。效果都差不多,有时候三个sh也很低。
跑目的蛋白wb毫无转染效果,但奇怪的是puro 10ng/ul筛细胞也不怎么死……
我转同门的质粒一次就成功,自己的这套就死活转不进😭求大佬指点可能出现问题的点。会是启动子或者载体选择有问题吗?可是pcdh和plko载体都是很成熟的商品了……
要毕不了业了啦😭
土井挞克树
你的试剂没有问题,考虑还是时间不合适,可以验证一下时间的适应性。
clarasun
目前各步骤的时间都是按试剂说明书操作的。时间适应性是指把dmem换成10%fbs的换液时间吗?
balalaLy
可能是质粒不行,重新找引物构建质粒
clarasun
同规格换过一批质粒了,还是不行🥹
loveliufudan
筛细胞时应该确保筛选的条件适当,并使用足够的puro毒素剂量。
转染效率可能受到转染试剂、密度等因素的影响,需要对这些参数进行调整。
如果使用了脂质体转染,请确保脂质体和质粒的比例适当。
在生物学实验中,尝试了多种不同的方法仍然无法获得期望的结果时,可能需要对质粒的设计和构建进行调整。