怎么绝对定量分析蛋白含量

蛋白质绝对定量分析依赖于已知浓度的内标肽（命名为AQUA），内标肽通常由含同位素的氨基酸的组成，以便与天然肽区分开来，利用串联质谱法检测引入了已知浓度内标肽的细胞裂解液，通过内标肽与天然肽的质谱测定比率，可以将天然肽的相对定量数值转化为绝对含量数值，在多肽、蛋白质水平测定以及蛋白翻译后修饰研究中广泛应用。

1、凯氏定氮及分光光度法蛋白质定量分析

利用蛋白质含氮量进行检测的经典方法，定量精准，但操作繁琐，仅用于标定蛋白质标准品和校正其他测定方法。凯氏定氮法有半微量法、微量法及全量法。样品与H2SO4一同加热消化，分析有机物，释放出的NH3与结合，碱化蒸馏使氮游离，硫酸吸收，HCI或H2SO4标准溶液滴定，从而计算蛋白质的含量。该方法是以Hantzsch反应为原理所建立的一种测试蛋白质含量的新分光光度法。适用于各类食品中蛋白质的测定，且不需要特殊的凯氏定氮装置。取样少，消化时间短，精密度高准确度好，适用于大批样品同时测定，亦适用于微量蛋白质分析，是一种蛋白质快速、准确定量的新途径。

2、双缩脲法蛋白质定量分析

双缩脲法简便易行，但检测灵敏度相对较低，最低测定值100ug。必须在测定前先使蛋白完全沉淀，除去干扰物质，才能得到较准确的结果。除三氯乙酸作沉淀剂外，还可用钨酸、磷钨酸和Tsuchiya试剂，双缩脲法优点是对白、红蛋白产生颜色反应相近、干扰物质少，不受温度的影响。但灵敏度低，0.01吸光度相当于166.7ug蛋白，且操作复杂，很难用于自动化仪器分析。

3、Lowry法蛋白质定量分析

结合双缩脲法中铜盐反应与Folin-ciocalteau试剂反应的特点，通过芳香族氨基酸残基Tyr和Try的迅速反应与肽链、极性侧链或两者的铜络合物较慢的反应。而把磷钼酸发色团还原成暗蓝色，在波长750nm处测定Amax.

4、BCA法蛋白质定量分析

BCA法的灵敏度为0.5-10ug/ml，其最低测定值与反应温度有关。有37摄氏度和60摄氏度2种反应温度：在37摄氏度时，一般适用于浓度较高的样品，但是色氨酸、络氨酸和肽键在此温度下得不到彻底的氧化；在60摄氏度时，一般适用于浓度较低的样品，色氨酸、络氨酸和肽键在此温度下能得到充分氧化，因此能大大提高检测灵敏度。

凯氏定氮及分光光度法可以实现定量分析