WB结果目的蛋白大小偏大是什么原因？

感觉是凝胶的问题 可以上个mk看看分子量1 回顾凝胶配制过程2是否蛋白发生聚合

多次跑WB结果都是偏大的话，是不是选用的marker蛋白分子量准确的呢？可以考虑尝试换其他的marker一起跑一下试试。另外需要考虑增加了flap标签后，蛋白分子量大小是不是也会增大？

是目的蛋白加flag标签理论分子量是75KD么，目标蛋白33KD，序列构建的时候核酸片段大小对不对？对比空菌，有没有其他新增的小片段蛋白表达？不排除标签掉了，或者蛋白降解或者聚集的问题。

可能有以下几个原因:

1. 融合蛋白序列克隆或表达过程中发生移码,导致蛋白质序列改变,蛋白相对分子量变大。

2. 样品制备过程中蛋白发生了聚集,表现为更大的分子量。可以试试不同条件下煮沸样品,看是否可以改变。

3. 蛋白在细胞内发生了一定的翻译后修饰,如糖基化、磷酸化等,增加了分子量。可以做脱糖基化实验验证。

4. SDS-PAGE电泳过程中的聚丙烯酰胺浓度或者交联度不够,影响了蛋白在胶中的迁移速率。可以试试不同聚丙烯酰胺胶。

5. 蛋白的构象影响了其在SDS胶电泳中的迁移性。也有可能是蛋白质之间的非共价相互作用影响。

6. 标记物蛋白梯度判断有误差,本身蛋白的相对分子量是准确的。

如果可以,可以进行蛋白酶切片实验查看切片后的大小;或者进行质谱分析确定精确分子量。这有助于判断蛋白本身大小的准确性。

和目的蛋白的结构，电泳迁移率，缓冲液组成等都有很大的原因。

融合蛋白大小偏大可能有以下几种原因：

1. 翻译后修饰：蛋白质在翻译后可能会发生各种化学修饰，例如磷酸化、糖基化等。这些修饰可能会增加蛋白质的分子量，导致WB检测到的蛋白质大小偏大。

2. 翻译后剪接：某些蛋白质在翻译后可能发生剪接，从而改变其分子量。例如，一些信号肽可能被切除，或者某些蛋白质可能在翻译过程中发生片段置换。

3. 蛋白质相互作用：在细胞中，蛋白质通常以复合物形式存在，这种相互作用可能导致蛋白质分子量偏大。

4. 蛋白质聚集：在某些条件下，蛋白质可能发生聚集，形成多聚体。这种情况下，WB检测到的蛋白质大小将大于预期。

5. 蛋白质降解或变性：如果蛋白质在实验过程中发生降解或变性，其分子量可能发生改变，导致WB检测到的蛋白质大小偏大。

6. 蛋白质样品处理：实验过程中的样品处理方法（如SDS-PAGE凝胶制备、样品上样等）可能会影响蛋白质的分子量，导致WB检测到的蛋白质大小偏大。

为了解决这个问题，您可以尝试以下方法：

1. 检测蛋白质上样量：确保蛋白质上样量适中，避免过少或过多导致条带不清晰。

2. 优化实验条件：调整实验条件，例如凝胶浓度、电泳时间、转膜时间等，以获得更好的分离效果。

3. 使用分子量标准：在WB过程中使用分子量标准，以校正实验中的误差。

4. 使用其他方法验证：尝试使用其他实验方法（如质谱、蛋白质互作实验等）来验证目的蛋白质的大小。

5. 优化抗原抗体反应：优化抗体稀释度、孵育时间和温度，以获得更好的抗原抗体反应。

注意以下几个方面，通常是糖基化的问题。

▪内源性蛋白 or 重组蛋白

查问题要从源头查起，所以各位艾粉们要先看一看样品是内源性蛋白还是重组蛋白？

如果是内源性蛋白还不打紧，如果是重组蛋白，那么马上就要看一看重组蛋白是否为全长序列了。假如样品是重组蛋白，还不是全长序列，那么条带大小一定会和预测大小不一致。

▪多个 isoform 辨仔细

如果确定了样品是内源蛋白，那就要看看我们的目标蛋白是不是有其他的 isoform，这个我们通常会去查看 NCBI 或者 SWISSPROT 来确认。

▪剪切活化要注意

如果在 SWISSPROT 或者权威的文献里提到了，样品的这个蛋白需要剪切活化，那么结果又要和预测值不同啦。

▪成倍增长多聚体

如果蛋白大小和预测值有明显倍数关系，那就要考虑一下这个蛋白是不是二聚体或者多聚体啦。

▪蛋白修饰要变大

如果排除了以上 4 条原因，预测值和实验结果不一致，那就是因为我们面对的蛋白质，是个善变的对象，它不仅会剪切活化，还有在翻译表达后修饰。

比如：比如甲基化、乙酰化、磷酸化、糖基化、烷基化、生物素化、谷氨酸化、甘氨酸化、硫酸化、异.戊二烯化、硫辛酸化、磷酸泛酰巯基乙.胺基化……balabala。

在不同状态下的蛋白质还会有不同的修饰。加入了官能团肯定会让蛋白质比预测值偏大。在日常的实验中，糖基化是比较常见的修饰，一般会导致跑出来的条带比预测值大那么一些。