空有黄昏亦打烊
前辈们好,我是一名普通本科学生。前不久导师颁发了一个任务,希望我能够在NCBI中找到防御素的目的基因。我找遍了防御素的目的基因,发现均为mRNA。我以为应该可以利用RT-PCR得到cDNA,但我的师姐说NCBI中提供了cDNA。(也就是说我的导师应该是希望能够直接找到cDNA,然后送去公司合成)
后来,我发现这些mRNA里边的U均为T,这是不是意味着其实NCBI种给出的mRNA就是我所寻找的cDNA(相同的那条链)?是不是就可以直接用这个mRNA了?于是我对比了部分文献中的序列和NCBI中序列的异同。我发现NCBI中的序列都比文献中长(即便是只用CDS序列)。后来我发现文献中提到密码子的优化,但是从某些文献上我得知优化实际上只改变其中几个碱基,整体并无大变化。所以我不知道为什么文献中的序列短于NCBI中的序列。但因为文献发布时间过早,在文献发布后的这几年NCBI上的数据有了一些变化。导致在对比文献上的序列和NCBI上的序列时,总是不同。
所以,为了让前辈们能够更明白我的疑惑。我将问题单独列出:
①NCBI中的mRNA是否就是cDNA的其中一条链?
②为什么文献中的基因序列比NCBI的基因序列短那么多?
③设计引物的时候是利用NCBI中mRNA内的CDS序列吗?
以上便是我的疑惑,再次感谢各位前辈不吝赐教了。
dxy_mqg1dtg8
1.NCBI中的mRNA通常是指已经被转录成mRNA的基因序列。而cDNA是通过反转录过程将mRNA转化为DNA而得到的。所以,可以说NCBI中的mRNA是cDNA的其中一条链,但并不是完全等同于cDNA。
2.文献中的基因序列比NCBI的基因序列短可能有多种原因。一种可能是文献中提及的基因可能只包含核心部分的序列,而NCBI中的序列可能包含了更多的非编码区域。另一种可能是NCBI中的序列可能经过了更新或修正,因此会包含更多的序列信息。
3.在设计引物时,通常会利用NCBI中的CDS序列。CDS序列是编码区域的序列,包含了编码蛋白质所需的信息。通过选择CDS序列作为引物设计的目标,可以确保引物会特异性地结合到目标基因的编码区域上。
空有黄昏亦打烊
好滴好滴,谢谢前辈
毛利小五郎的徒弟
首先,打开NCBI主页,选择需要查询的数据库,以查询基因序列为例,选择“Gene”,并在搜索框内输入查询内容,点击Search。若是您感兴趣的是防御素蛋白相关的信息,可以选择“Protein”;
Search后出现所有已经Report的所有序列,以及基因名称、种属、ID号等信息
空有黄昏亦打烊
好滴好滴,谢谢前辈
sswei
如果是CDS和CDS比较,确定是coding的部分少了200多,那有可能是alternative splicing或者alternative transcription start/end sites。在不同的组织、发育时期、生理状态下出现alternative splicing比较正常,这样的话你做的就是一个isoform。另外你还可以再确认一下,有时候会有3’UTR或者特殊的3‘端的序列editing,这样一来也会导致长度出现明显差别。如果你现在的结果对于基因的功能研究都比较确定,可以查一查这个基因在其他物种里有没有alternative splicing的现象,然后当成一个isoform就好了,没什么影响。
空有黄昏亦打烊
谢谢前辈的耐心回答,您说的这些专业术语我暂时没有涉及到,所以不太能看懂,但能够体会您的用心回答。希望以后再次看到您的评论是我能够了然于心。
loveliufudan
1. NCBI中的mRNA序列不完全等同于cDNA序列,但两者有很大重合部分。mRNA是通过转录自DNA而来的单链核酸序列,包含外显子序列。cDNA是通过逆转录酶反转录合成自mRNA而来,也包含外显子序列。但cDNA还包含5'端帽结构和3'端聚A尾。所以mRNA和cDNA在内含序列上有很大的重合性,但并不完全一致。
2. NCBI中的基因序列可能比文献报道的序列短的原因有:
(1) NCBI采用的基因序列来自更准确的最新测序结果;
(2) 文献报道的序列可能只是对基因片段的测序;
(3) NCBI序列去除了一些内含子序列。
3. 设计引物时主要是基于mRNA序列的编码区CDS设计。CDS代表编码蛋白质的区域,对应于外显子序列。设计引物时选取CDS区域,可以保证扩增出的片段包含编码蛋白质的序列信息。
空有黄昏亦打烊
前辈您好,谢谢您的耐心回答,但是我还有疑惑。这几天我看了一些文献,发现了两种不同的方法。
第一种是:找到cDNA,然后设计引物PCR,再将双酶切后的质粒和cDNA连接,从而构建载体。(但是很遗憾,我寻找的目的基因全是mRNA,没有出现cDNA,如:NM_001001609.3是鸡-β防御素10。我的师姐虽然说NCBI里边有cDNA,但她之前做防御素6和9时是直接引用一篇文献里边所给的序列,所以具体不知道在哪儿可以找到cDNA。)
所以主要想请教,像鸡β防御素这种只有mRNA的抗菌肽应该怎么确定目的基因(是不是把mRNA里边的CDS序列作为cDNA),但是这个PCR扩增后的目的基因应该如何与质粒连接。
第二种:直接找到成熟肽段mRNA,然后进行密码子优化,之后在两段加入保护碱基、酶切位点以及化学切割点后,送到公司合成,然后将目的基因克隆到pUC57载体上。之后分别扩增含pET-32a(+)的宿主菌和含pUC57的宿主菌,再分别提取双酶切,然后再将目的基因连接到pET-32a(+)上。
针对这一种文献的方法,我想提问:如何把这个合成好的目的基因克隆到载体上的?是公司在合成好目的基因以后就顺便克隆到质粒上了吗?
谢谢前辈了,真的感激不尽。
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