WB整膜一抗怎么敷

通常分为两个步骤。以下是一般的步骤：

1. 样品处理和电泳：首先，您将蛋白样品经过电泳分离，并转移到膜上。这可以通过SDS-PAGE等方法完成。在转膜之前，您可以在凝胶中加入分子量标记物以便于确定目标蛋白的位置。

2. 阻断：转膜完成后，您需要对膜进行阻断（blocking），以防止非特异性结合和减少背景信号。常用的阻断剂包括牛血清蛋白（BSA）、脱脂乳清蛋白（skim milk）等。选择合适的阻断剂并进行适当的浓度优化。

3. 一抗孵育：将一抗稀释到适当的浓度中，根据实验需要在阻断液中孵育膜。一抗与目标蛋白特异性结合，形成一抗-蛋白复合物。孵育时间一般为数小时至过夜，可以根据实验要求和抗体的特性来确定最佳的孵育时间。

4. 洗涤：将膜从一抗溶液中取出，进行多次洗涤以去除非特异性结合的一抗。洗涤液一般为含有Tween 20的缓冲液，如Tris-buffered saline with Tween (TBST)。

5. 二抗孵育：选择合适的二抗（secondary antibody），将其稀释到适当的浓度中，根据一抗的动物源（如兔、小鼠等）和实验所用的检测方法（如辣根过氧化物酶-HRP或碱性磷酸酶-AP等）进行选择。将膜孵育于二抗溶液中，使其与一抗-蛋白复合物发生反应。

6. 洗涤和显色：将膜从二抗溶液中取出，进行多次洗涤以去除非特异性结合的二抗。最后，使用适当的显色剂，如ECL（Enhanced Chemiluminescence）试剂盒，检测目标蛋白的信号。

一抗（3%脱脂牛奶抗体稀释液），加TBST按适当比例稀释一抗。然后裁下一块封口膜折成小船，铺于湿盒中，将脱脂奶粉加到小船中，用移液枪把一抗注进奶粉溶液里，摇床上摇一会，膜蛋白面朝下，放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留的气泡；摇床上摇半小时后，放在湿盒中，在4℃下过夜，一抗孵育完成。

如果膜比较大的话只能分开敷了，但是要注意孵育的条件要保持一致