Takeyourtime4FT4
想问一下用Krytox和PFH材料制备纳米液滴,在透析除盐的时候为什么会出现沉淀呀?感觉是这些纳米液滴聚集在一起了。在还没有透析的时候摇一下是可以摇匀的,但是静置后会沉淀在底部,如果将其摇匀后拿去透析就会慢慢出现沉淀,一开始我以为这个沉淀是液滴破了之后的Krytox等组织,结果发现不是,我将这些沉淀拿出啦搓一下发现变成了水状了,就不是沉淀了,也不知道为什么,聚集之后用超声也分散不开。有哪位大神可以帮我解答这个疑惑吗?请赐教,拜托了!
lijUn5895
蛋白透析产生沉淀可能有以下原因:1.由高浓度的蛋白变性试剂(如8m尿素),到低浓度,再到不含变性剂的buffer,如果条件变化剧烈,使得蛋白不正确折叠而沉淀,这种情况比较常见。如果选择透析的方法,一定要多加几个中间浓度梯度,而且注意低温(4度),这有利于蛋白正确折叠。2.透析袋本身有一定的吸附,可以通过磁力搅拌来降低吸附。3.透析液PH靠近等电点,像catzp说的,换buffer。4.透析袋不干净?楼主不会范这种错误吧。或者没认真处理,有杂质、金属离子建议:1 可以采用梯度浓度透析,先采用与你纯化后蛋白盐浓度相近的透析液透析,4-8小时后换更小浓度的盐溶液透析,最后采用生理盐水或PBS (pH 7.4)透析。例如:用6M盐酸胍沉淀的目的蛋白,第一步透析可采用4M盐酸胍透析,4-8小时后采用2M盐酸胍透析,再之后可以使用PBS 或生理盐水。2 透析液的pH值不要和目的蛋白的等电点接近,这样目的蛋白可能会更容易沉淀。3 保持蛋白浓度在mg/ml量级上面。4 用20mM的醋酸透析也能降低沉淀5 加一些保护剂,如蔗糖,甘油,巯基乙醇等。6 减少脱盐时间。可考虑用超滤或者G系列的凝胶脱盐,这样时间较快,减少蛋白质的变性。7 增加蛋白质浓度也可在一定程度上减少透析过程中蛋白质的沉淀,不过效果不是特别好的。8 最后,不排除是蛋白不稳定的可能性,可在提纯开始时加点甘油,浓度控制在10-25%左右。
Eason老歌迷
(这个是13年丁香通上发的攻略,希望对你有帮助。)蛋白透析产生沉淀可能有以下原因:
1. 由高浓度的蛋白变性试剂(如8m尿素),到低浓度,再到不含变性剂的buffer,如果条件变化剧烈,使得蛋白不正确折叠而沉淀,这种情况比较常见。如果选择透析的方法,一定要多加几个中间浓度梯度,而且注意低温(4度),这有利于蛋白正确折叠。
2. 透析袋本身有一定的吸附,可以通过磁力搅拌来降低吸附。
3. 透析液PH靠近等电点,像catzp说的,换buffer。
4. 透析袋不干净?楼主不会范这种错误吧。或者没认真处理,有杂质、金属离子
建议:
1. 可以采用梯度浓度透析,先采用与你纯化后蛋白盐浓度相近的透析液透析,4-8小时后换更小浓度的盐溶液透析,最后采用生理盐水或PBS(pH 7.4)透析。
例如:用6M盐酸胍沉淀的目的蛋白,第一步透析可采用4M盐酸胍透析,4-8小时后采用2M盐酸胍透析,再之后可以使用PBS或生理盐水。
2. 透析液的pH值不要和目的蛋白的等电点接近,这样目的蛋白可能会更容易沉淀。
3. 保持蛋白浓度在mg/ml量级上面。
4. 用20 mM的醋酸透析也能降低沉淀
5. 加一些保护剂,如蔗糖,甘油,巯基乙醇等。
6. 减少脱盐时间。可考虑用超滤或者G系列的凝胶脱盐,这样时间较快,减少蛋白质的变性。
7. 增加蛋白质浓度也可在一定程度上减少透析过程中蛋白质的沉淀,不过效果不是特别好的。
8. 最后,不排除是蛋白不稳定的可能性,可在提纯开始时加点甘油,浓度控制在10-25%左右。
天一湖医者
可能是你透析时浓度较高,或者增加离子强度,或者调整PH试一试