有木有人教学一下大分子量的蛋白应该如何操作呀？

250kd的蛋白不好做，分离胶用7％，积层胶 3.5％。这种分子量蛋白建议加大电泳电转的电场强度和加长作用时间，但必须控制温度，保证低温电泳和电转。

做western blot印迹膜时，较大的蛋白质众所周知是难以处理的。 特别是，您可能很难实现良好的转印效率。 在某些方面，蛋白质难以朝着你想要的方向前进。 我们将给5点建议，帮助胶上大分子量蛋白的转印。 01 牺牲胶的韧性来提高效率 低浓度的丙烯酰胺凝胶可能难以操作。一旦手指触摸它就会撕裂？ 但是，与高浓度的凝胶相比，大蛋白将更有效地从较低浓度的凝胶中移出（分辨率更好）。因此，提高你的灵活性和耐心，尝试6-7.5％的凝胶。 或者可以尝试使用梯度凝胶，可以同时分辨小分子量和大分子量蛋白质。 02 去除去垢剂 较大的蛋白质可能在凝胶中沉淀，抑制转印。 在SDS-PAGE期间添加的SDS通常会解决这个问题，但较大的蛋白质可能需要更多的SDS。 您可以在转印缓冲液中添加最多0.1％的SDS以阻止沉淀的产生。因为SDS抑制蛋白质与膜的结合，因此请尝试从低浓度的SDS开始（例如0.0375％），然后逐步提高。 如果确实在转印缓冲液中添加了SDS，则需要重新优化其他转印条件，如转印时间和电流，以防止蛋白透过膜。 03 降低甲醇浓度 甲醇与SDS具有相反的作用。 虽然甲醇增加蛋白与膜的结合，但它从蛋白质中剥离SDS。 因此，降低转印缓冲液中的甲醇浓度也有助于防止蛋白沉淀。 您可以将浓度降低到10％或更低。 如果您使用的是PVDF膜，则可以完全省去甲醇。 在使用之前，不要忘记用甲醇将膜激活！ 甲醇也会导致凝胶收缩，所以如果减少甲醇，你的凝胶会膨胀得更多。 这也有助于转移大分子量蛋白。 但您可能需要使用比正常情况稍大的滤纸和膜。 04 慢速转印大分子量蛋白 大分子量蛋白想要获得良好的转移效率可能需要更多时间。 快速移动那些大分子可能很困难。 尝试以较低的电压过夜转印。 只是不要忘记保持转印要在低温环境！ 05 使用湿转 虽然半干转印可能更适合设置并且需要较少的缓冲液，但它确实有其缺点。 半干转印通常比湿转移效率低，并且不能增加转印时间以适应更大的蛋白。 转移大蛋白时最好坚持使用湿转。

超过200以上的蛋白，可以用8%的胶，注意一定买个分子量差不多的marker，这样跑胶的位置，可以大概估算出来。转膜时间可以延长，300mA，可以跑3h。第一次做的时候，看marker转没转过去。转膜时注意低温。选大公司的抗体，或者是别人通过确定好用的抗体。

换6%的胶，转膜电流和时间都相应延长