western blot实验条带颜色整体都很深，是什么原因造成的？做完了还能再改进么？

做完了还想改进基本不会太好看，还是要控制背景值，洗脱干净。一般照相的软件可以调整一下曝光度，具体怎么调可以尝试一下。

1.未进行非特异性封闭或封闭不充分

延长封闭时间，考虑更换合适的封闭剂。 推荐 5% 脱脂奶粉、3% BSA 或血清封闭 30 分钟。

2.一抗浓度过高

稀释抗体至合适浓度，以更高稀释度抗体孵育更长时间（耗时长但特异性结合最好）。

3.孵育温度过高

4 ℃ 下孵育。

4.二抗与封闭剂非特异性结合或反应

设置二抗对照(不加一抗)。

5.一抗或二抗与封闭剂有交叉反应

在孵育和洗涤液中加入温和去污剂如吐温 -20。脱脂奶粉含有酪蛋白，该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白，会结合磷酸化特异性抗体而易产生高背景。使用BSA代替奶粉作为封闭剂。

6.未结合蛋白质洗涤不充分

增加洗涤次数。

7.膜的选择导致的高背景

NC 膜比 PVDF 膜背景低。

8.膜干燥

在孵育过程中防止膜变干，在任何步骤都保证膜有充分的反应液，放入搅拌子不断搅动或轻轻振荡使膜浸在溶液中，避免出现干膜现象。

可能原因：

1.一抗或/和二抗浓度太深，孵育时间过长。可以降低一二抗的浓度比例和孵育时间。

2.封闭时间短。可适当延长封闭时间。

3.洗膜时间和次数不够。可适当增加，5miundefined5次或者10miundefined3次。

可能是封闭不彻底，建议更换封闭液，用TBST多洗几次

可能原因有很多，你可以逐个排查:

1.封闭时间不够或封闭液不行，建议用5%脱脂奶粉封闭，封闭时间至少1h；

2.洗液被污染或一抗和二抗洗涤不充分，建议更换新鲜洗液，同时延长洗涤时间和次数，比如增加到5次，每次5mim；

3.ecl发光液是超敏ecl，可以用tbst稀释一下或者用普通ecl曝光；

4.pvdf膜被污染，操作过程中一定不能用手碰到膜，很容易粘上脏东西被污染；

5.如果是组织提取蛋白做实验的话，可能存在杂蛋白干扰，建议上样前高速离心一下；或者是蛋白丰度太高，可以减少上样量再尝试；

6.一抗有问题，可以带一个阳性对照一起实验，如果阳性对照也做不出来，那就说明是抗体问题了；

可能二抗浓度太高了，将条带用洗膜液洗洗，然后重新加稀释的二抗，显影