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跑磷酸化蛋白有什么要特别注意的吗?出来的条带不明显,几乎看不到。

相关实验:蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)

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RIRI00

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3 个回答

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staywalking

有帮助

1.收集细胞在冰上,加入磷酸酶抑制剂。足量裂解液。

2.超声样本,促进蛋白溶解。

3.增加上样量到40ug.

4.根据推荐的方法稀释抗体。

5.洗膜 TBST 5分钟三次。

6.确定总蛋白是否有表达。然后排查该位点磷酸化是否被诱导,是否在合适的检测窗内(多设时间段)。用成熟的诱导Model制备阳性对照,可能你的模型或者样本里这个位点就是没有被磷酸化。

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毛桃子啊

有帮助

加入充足的磷酸酶抑制剂,并始终将样品置于冰上,使蛋白保持在磷酸化的状态。

使用 5% w/v BSA 而非牛奶(牛奶中包含的酪蛋白是一种磷酸化蛋白;而抗体会检测牛奶中的酪蛋白导致高背景)封闭膜。

磷酸化可能需要被诱导。信号弱或无信号可能意味着诱导不充分。建议使用推荐的阳性对照。

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whilt-shirt

有帮助

在提蛋白过程中加磷酸酶抑制剂,蛋白浓度定的高一点,上样量多一点

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