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稳定株real-time PCR检测表达升高1000倍 WB检测蛋白没有明显变化是为什么?

相关实验:蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)

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dengchch

最近开始一个gene功能的新课题,建立了过表达的稳定株,准备做功能。首先用real-time PCR和WB进行验证,发现过表达稳定株相对于空载体mRNA升高了至少1000倍,但WB检测蛋白只有很少的上升。蛋白是一个跨膜蛋白,载体是pBABE。抗体正常,因为在细胞系中已验证有作用。感觉蛋白只有少量的上升,不足以引起功能上的明显变化。现在这种情况,不知道是什么原因,都不能往下做实验了。所以想请教一下大家,对于这种情况,有什么合理的解释。
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3 个回答

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远航TAJI

有帮助
qPCR结果达一千倍不合理,结果不可用,可能是假阳性。
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hl16010921

有帮助
mRNA的量和蛋白表达量不是线性相关的,有时甚至不是正相关的(特别是抑制核糖体的调控因素时常常如此)。WB反应的是蛋白表达情况,mRNA上升1000倍,但细胞不可能将所有的核糖体都用于翻译这个蛋白,另外细胞膜的空间能容纳1000倍的该蛋白吗(细胞膜本身就镶嵌了大量蛋白,细胞大小不变,膜的表面积也就不变)。还有你看看是否可以用该蛋白敲除的细胞作空白对照,现在无法排除质粒本身会影响该蛋白的內源性表达。但总的来说WB有上调就是好消息。建议找个该蛋白不表达的细胞系作空白或阴性对照。
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elite_xy

有帮助
mRNA多不等于蛋白表达量高
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