求载体构建的完整步骤和需要注意的事项哇

载体构建的注意事项：

1．连接反应是 DNA 重组过程中的关键步骤，其成败的重要参数之一就是温度，因此要控制好连接温度。

2．进行黏末端连接时，会产生一定数量的载体自身环化分子，导致转化菌中过高的假阳性克隆背景。针对这一问题，常采用牛小肠碱性磷酸酶（ CIP ）去掉载体的5’﹣磷酸以抑制 DNA 片段的自身环化。

注意事项

1．连接产物可短时间在﹣20’℃保存，使用时可以取出进行后续实验；

2．在细胞转化时，冰浴和热激要严格控制好时间；

分切接转筛，这个最好找本分子克隆，自己慢慢看看，因为每一步都可能出问题，最好先看明白再做。