小鼠受精卵慢病毒显微注射后发育至2细胞就不发育了怎么回事？
旧人EJYH
做了几次预实验，用C57的雌鼠PMSG+HCG超排后配种，次日下午注射带GFP标签的慢病毒，注射后当时死亡的胚胎不多，但是注射后次日发育到2细胞的胚胎就停止发育，然后就死了。其中慢病毒浓缩后是用养293T细胞带血清的DMEM（+）稀释的，滴度在10的6至8次方个单位。想问一下是不跟这个有关系？血清里边有激素。
2 个回答
土井挞克树
先降低一下滴度，然后可以调整一下慢病毒类型，使用高滴度高纯度的慢病毒，可以减少病毒中的杂质对细胞状态的影响：降低慢病毒对细胞的毒性
另外调整细胞状态，感染时使用对数期的细胞
旧人EJYH
- Science在2004年发表的文章利用慢病毒显微注射制备转基因小鼠，毒的滴度为10的9次方，注射量为50-100 pL，pbs稀释浓缩离心后的毒。我使用的毒也是pbs稀释，大概在6-7次方，注射量不超过10 pL，正常刚打完之后如果胚胎有问题就死了，我打完之后死的不多，培养到次日胚胎里边的胞质就散，细胞就死了，发育2细胞胚胎就阻滞不发育了。
- 毒的滴度已经很低了，再低的话就没有那么强的侵染效率了，所以可能还是过表达时载体的问题。
- 用的受精卵是能够看到雌雄原核的受精卵，晚上超排后合笼，次日11点取受精卵，下午2点开始注射，整个注射时间不超过2h，所以胚胎的问题应该也可以排除。
- 做对照组培养箱和培养液都没问题，可以正常发育至桑椹胚。
除了毒的问题，我实在想不出还有什么原因会导致胚胎停滞或死亡了。
loveliufudan
可能有多种原因，包括慢病毒的毒性、注射技术和实验条件等。
首先，慢病毒是一种有机病毒，可以导致宿主细胞死亡，影响胚胎的发育。您使用的带GFP标签的慢病毒浓度在10^6-8的单位，也可能对小鼠受精卵造成了毒性影响。因此，建议您优化慢病毒的浓度和处理方式，以减少慢病毒对胚胎的不良影响。
其次，注射技术也可能是一个问题。小鼠受精卵非常脆弱，需要非常小心和精确的技术才能成功进行显微注射。注射的位置、深度和角度等因素都可能影响胚胎的发育和生存。建议您检查注射技术，确保注射位置和注射量都准确无误。
最后，您提到使用含有血清的DMEM稀释慢病毒。血清中含有激素，可能会对小鼠受精卵的发育产生影响。因此，建议您尝试使用无血清培养基，或对血清进行更多的筛选，以降低血清中激素对胚胎的影响。
旧人EJYH
- Science在2004年发表的文章利用慢病毒显微注射制备转基因小鼠，毒的滴度为10的9次方，注射量为50-100 pL，pbs稀释浓缩离心后的毒。后边也有好多文章说是毒的滴度和注射量都是这样，目前我的毒的滴度和注射量都比报道的要小，而且我使用的毒也是pbs稀释，大概在6-7次方，注射量不超过10 pL，正常刚打完之后如果胚胎有问题就死了，我打完之后死的不多，培养到次日胚胎里边的胞质就散，细胞就死了，发育2细胞胚胎就阻滞不发育了。毒的滴度已经很低了，再低的话就没有那么强的侵染效率了，所以可能还是过表达时载体的问题。
做对照组培养箱和培养液都没问题，可以正常发育至桑椹胚。
注射系统问题不大，之前做小鼠的受精卵核空腔注射胚胎也能正常发育，那个针尖插的位置要更深，并且可能会损伤核仁。透明带下注射只需要扎破透明带注射就行，对胚胎的损伤要更小。所以很有可能还是过表达载体的问题。
除了毒的问题，我实在想不出还有什么原因会导致胚胎停滞或死亡了。
