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小鼠受精卵慢病毒显微注射后发育至2细胞就不发育了怎么回事?

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旧人EJYH

做了几次预实验,用C57的雌鼠PMSG+HCG超排后配种,次日下午注射带GFP标签的慢病毒,注射后当时死亡的胚胎不多,但是注射后次日发育到2细胞的胚胎就停止发育,然后就死了。其中慢病毒浓缩后是用养293T细胞带血清的DMEM(+)稀释的,滴度在10的6至8次方个单位。想问一下是不跟这个有关系?血清里边有激素。

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2 个回答

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毛利小五郎的徒弟

有帮助

先降低一下滴度,然后可以调整一下慢病毒类型,使用高滴度高纯度的慢病毒,可以减少病毒中的杂质对细胞状态的影响:降低慢病毒对细胞的毒性

另外调整细胞状态,感染时使用对数期的细胞

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旧人EJYHuser-title

  • Science在2004年发表的文章利用慢病毒显微注射制备转基因小鼠,毒的滴度为10的9次方,注射量为50-100 pL,pbs稀释浓缩离心后的毒。我使用的毒也是pbs稀释,大概在6-7次方,注射量不超过10 pL,正常刚打完之后如果胚胎有问题就死了,我打完之后死的不多,培养到次日胚胎里边的胞质就散,细胞就死了,发育2细胞胚胎就阻滞不发育了。
  • 毒的滴度已经很低了,再低的话就没有那么强的侵染效率了,所以可能还是过表达时载体的问题。
  • 用的受精卵是能够看到雌雄原核的受精卵,晚上超排后合笼,次日11点取受精卵,下午2点开始注射,整个注射时间不超过2h,所以胚胎的问题应该也可以排除。
  • 做对照组培养箱和培养液都没问题,可以正常发育至桑椹胚。

除了毒的问题,我实在想不出还有什么原因会导致胚胎停滞或死亡了。

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loveliufudan

有帮助

可能有多种原因,包括慢病毒的毒性、注射技术和实验条件等。

首先,慢病毒是一种有机病毒,可以导致宿主细胞死亡,影响胚胎的发育。您使用的带GFP标签的慢病毒浓度在10^6-8的单位,也可能对小鼠受精卵造成了毒性影响。因此,建议您优化慢病毒的浓度和处理方式,以减少慢病毒对胚胎的不良影响。

其次,注射技术也可能是一个问题。小鼠受精卵非常脆弱,需要非常小心和精确的技术才能成功进行显微注射。注射的位置、深度和角度等因素都可能影响胚胎的发育和生存。建议您检查注射技术,确保注射位置和注射量都准确无误。

最后,您提到使用含有血清的DMEM稀释慢病毒。血清中含有激素,可能会对小鼠受精卵的发育产生影响。因此,建议您尝试使用无血清培养基,或对血清进行更多的筛选,以降低血清中激素对胚胎的影响。

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旧人EJYHuser-title

  • Science在2004年发表的文章利用慢病毒显微注射制备转基因小鼠,毒的滴度为10的9次方,注射量为50-100 pL,pbs稀释浓缩离心后的毒。后边也有好多文章说是毒的滴度和注射量都是这样,目前我的毒的滴度和注射量都比报道的要小,而且我使用的毒也是pbs稀释,大概在6-7次方,注射量不超过10 pL,正常刚打完之后如果胚胎有问题就死了,我打完之后死的不多,培养到次日胚胎里边的胞质就散,细胞就死了,发育2细胞胚胎就阻滞不发育了。毒的滴度已经很低了,再低的话就没有那么强的侵染效率了,所以可能还是过表达时载体的问题。

做对照组培养箱和培养液都没问题,可以正常发育至桑椹胚。

注射系统问题不大,之前做小鼠的受精卵核空腔注射胚胎也能正常发育,那个针尖插的位置要更深,并且可能会损伤核仁。透明带下注射只需要扎破透明带注射就行,对胚胎的损伤要更小。所以很有可能还是过表达载体的问题。

除了毒的问题,我实在想不出还有什么原因会导致胚胎停滞或死亡了。

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