TH17细胞体外诱导分化比例过低

还是需要把电压调回正常的水平，然后可以加入促诱剂

从您提供的实验步骤来看，您已经添加了TGF-B、IL-6、IL-23和IL-18等诱导因子，这些因子通常是用于促进Th17细胞分化的。因此，如果您的Th17细胞诱导分化比例过低，有以下可能的原因：

初始CD4+T细胞的纯度不够高：在步骤（2）中，您使用磁珠分选的方法制备了初始CD4+T细胞，但如果初始CD4+T细胞的纯度不够高，可能会导致Th17细胞分化比例下降。您可以尝试使用更严格的细胞分选方法，如荧光激发分选（FACS）来提高CD4+T细胞的纯度。

诱导因子的浓度不够适宜：在步骤（3）中，您添加了TGF-B、IL-6、IL-23和IL-18等诱导因子，但是这些因子的浓度可能需要进一步优化。您可以尝试不同浓度的诱导因子，找到最适宜的浓度组合来提高Th17细胞分化比例。

细胞培养条件不够适宜：Th17细胞分化需要特定的细胞培养条件，如温度、气氛、培养基等。您可以尝试优化细胞培养条件，比如增加CO2浓度、添加适量的细胞因子等来提高Th17细胞分化比例。

实验步骤中存在操作误差：在实验过程中，可能会存在一些误差，如误加试剂、操作不规范等。您可以检查实验步骤，排除可能存在的误差。

总之，提高Th17细胞分化比例需要综合考虑多个因素，建议您对实验步骤进行优化，并对比对照组和实验组的实验条件和操作过程，找到可能存在的差异点并进行改进。

可以按照以下步骤进行：

1、 TCRTq BALB/c小鼠单个细胞的制备 简言

之， 取小鼠的脾脏， 研磨， 筛网过滤，然后经小鼠淋巴细胞分离液密度梯度离心(800

r/min，30 min)，收取单个核淋巴细胞，计数，用RPMI1640培养液(含100 mLL灭活胎生血清、 50 g儿L谷胺酰胺、 100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素、50 mol/L2ME)调整细胞密度为3x109/L，

2 、细胞培养 新鲜分离的DO11.10小鼠单个核

细胞与同背景BALB/c小鼠单个核细胞悬液按1:4比例混合，在有/无OVA多肽(OVA

323339，1mg/L)、相应细胞因子(TGFB1 ug/L、IL610 ug/L、IL23 10 ug/L或抗细胞因子抗体alFNy5 mg/L、alL45 mg/L)不同组合的情况下培养4 d后， 新鲜RPMI1640培养液中加入低剂量IL2(10 U/mL)继续培养2 d，收集细胞，加入OVA多肽和aCD28(终浓度1

mg/L)，刺激的第1 h后，加入BFA继续培养4h，用于细胞内细胞因子染色。

3 、ELISA检测 培养4 d的细胞， 收集上清

液， 低剂量IL2(10 U/mL)悬浮细胞2 d，调节细胞密度到3x109儿。刺激孔加入OVA多肽和

aCD28，每个样品于96孔培养板上置3个复

孔， 200 uL/孔，37℃、50 mL/L CO2培养48 h后， 收集培养上清液，检测细胞因子浓度，

按照ELISA试剂盒说明书操作，酶联检测仪检测

结果。

4 、细胞染色 首先进行细胞表面染色，简言之，细胞悬液，加入荧光标记的抗细胞表面特异性抗原的抗体， 4℃避光反应30 min， 洗涤2次(800 r/min，8 min)。之后进行细胞内细胞因子染色， 即将待测细胞用PBS洗涤2次后，

加入40 mLL多聚甲醛，室温固定8 min，洗涤，加入含有通透剂的缓冲液4℃过夜破膜，加入特异性的胞内标记mAb，4℃避光反应30min， 洗涤2次， 染色缓冲液重悬细胞， 流式细胞术(FCM)进行检测。

5 、FCM分析 应用FCM进行检测。首先设门于淋巴细胞，再以CD4+KJ1.26+双标记细胞群

开窗，CellQuest收集10000个细胞，FlowJo

软件分析FCM结果。

6 、统计学处理 所获数据用x±s表示，显著性

检验采用t检验分析。