为什么二次pcr出来的条带还是这么浅，是胶的问题吗

我之前也遇到过这类情况。引物、模板没问题的话,就加cycle,多扩几轮,就亮了（一般pcr酶和buffer是没有问题的,除非你反复冻融或者长时间放置室温）如果上一轮扩出来特异性好的话,可以适当降低退火温度.多扩了几轮,退火温度也降低了,但是条带仍然很淡,这时候,基本上就是引物和模板的问题了.你要好好看看引物特异性好不好,dimer亮不亮,（自身发夹一般不会有太大影响）；模板的话,要看看GC含量高不高,模板质量好不好。引物不好只能重新设计。模板不好可以加点DMSO（GC含量高）,或者重新提取。

调整胶的ph和胶的浓度，之后再跑。

胶有些问题，marker也很淡，但两次扩增，pcr条带应该很亮，检查一下你的引物是否合适？

可能是胶的问题，因为你的marker都好模糊。或许电泳液也有问题。

首先排除引物、模板问题,如果没有问题就加cycle,多扩几轮,就好了。