PCR的问题与优化

互联网2013-09-06

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PCR 的优化

在 PCR 的优化开始阶段，应用新的 DNA 模板，引物或热稳定 DNA 聚合酶等材料建立的 PCR 方法，其扩增效果一般总不是最佳的。这种 PCR 反应通常要求尽量抑制非特异性扩增和（或）增加目的 DNA 产物的产率。表 1 列举了一些通常遇到的问题和对 PCR 反应进行优化的一些推荐方法。

表 1 PCR 扩增的疑难解析

问题

解释

补救措施

目的产物条带在两种阳性对照管与试验管内部呈现明显的非常模糊的带型。目的产物条带有时呈不清晰的成片条带，条带在凝胶中扩散到较期望分子量更小的 DNA 分子量的区域内。

无效引导或无效延伸

通过建立两个引物不同浓度的 PCR 系列试验，从中发现两个引物的最适浓度；通过建立降落 PCR 系列试验，摸索最佳镁离子浓度的水平。

应用 GC-Melt （ Clonte-CH ） PCR 反应混合液。

应用尽可能低的复性温度（即退火温度）考虑添加佐剂，如在反应体系中加牛白蛋白（ 0.2~0.6mg/ml ），二甲基亚砜（ 5% ）或甘油（ 5% ）

目的产物条带在阳性对照管 2 与试验管内呈现非常模糊的带型，而在阳性对照管 1 内却又很强的条带。

模板 DNA 不纯。

重新纯化模板 DNA ，用酚：氯仿抽提两次，乙醇沉淀回收。纯化后的 DNA 样品溶解于水中（不含 EDTA ）。

在阴性对照管扩增出目的条带。

盛模板 DNA 的塑料器具溶解模板 DNA 的溶液污染所致。

重新配置新的试剂。

扩增产物呈现明显的分子质量错误的条带。

根据一条或两条引物的非特异性引导。

缩短复性时间或增加复性温度。

扩增目的产物 DNA 呈现模糊的广泛的成片条带。

要么为引物二聚体所致的扩增；要么为模板 DNA 过量。

检查引物是否均一及模板 DNA 序列内是否具有高度重复序列存在。优化每条独立引物的浓度。

应用降落 PCR 和（或）热启动 PCR 。降低模板 DNA 的量。

对可能发生在 PCR 过程中的主要问题的解析

表 2 描写在 PCR 扩增反应中可能遇到的一些问题以及提供怎样解决这些问题的一些方法。

表 2 多种 PCR 扩增过程的一些疑难问题的诊断与解决方法

症状

可能原因

补救措施

扩增的目的产物条带较弱或不能检测到相应的条带。

试剂不合格； PCR 仪有故障；扩增程序设置错误。

在两台不同的 PCR 仪上用新鲜购买的试剂与老的试剂分别进行 PCR ，比较其扩增产物结果。

复性条件不是最合适的。

重新计算引物 Tm ；应用降落 PCR ，最好再结合热启动 PCR 。

验证引物浓度，如果必要可优化引物的浓度；若引物显然是问题的症结所在，重新设计合成新的引物。

被复性结合到模板上的引物不适合延伸。

优化 MgCl₂ 、模板 DNA 和 dNTP 的浓度；试验此 PCR 的 pH 值的范围；考虑用 N- 三甲基甘氨酸、 N,N- 二羟乙基甘氨酸或 EPP 等具有更低温度变异系数的化学物质替代 Tris （ Cheng et al. 1994 ）。

应用新鲜制备的热稳定 DNA 聚合酶。

重新纯化模板 DNA 以去除抑制物。

在恒定复性温度（ 55 ℃）条件下增加 PCR 循环数。

如果问题依然存在，添加增强剂（如 10% 二甲基亚砜， 5% PEG6000 或 10% 甘油）。

如果问题依然存在，用首次扩增的 PCR 产物进行 1 ： 100 稀释后作为模板，再加入新的 PCR 缓冲液与引物在恒定复性温度条件下进行 30 个循环的第二次 PCR 扩增；或者进行嵌套式 PCR 扩增。

应用 GC-Melt （ CLONTECH ） PCR 反应混合液。

变性不完全。

增加变性的时间或者设置更高的变性温度。

两个引物之间的距离太大。

应用那些能够扩增大 DNA 片段的热稳定 DNA 聚合酶。

多种扩增产物条带

应用降落 PCR ，最好再结合热启动 PCR 或加强 PCR （ booster PCR ）。

优化 MgCl₂ 、模板 DNA 、热稳定 DNA 聚合酶及 dNTP 的浓度。

用首次扩增的 PCR 产物进行 1 ： 100 稀释后作为模板，再加入新的 PCR 缓冲液与引物在恒定复性温度条件下进行 30 个循环的第二次 PCR 扩增；或者进行嵌套式 PCR 扩增；或者从凝胶上切割目的条带作模板重新进行 PCR 扩增。

确证引物的浓度，如果必要，可优化引物的浓度；若问题仍然存在，重新设计合成引物。

引物二聚体过量

应用降落 PCR ，最好再结合热启动或加强 PCR （ booster PCR ）；若问题仍然存在，重新设计合成引物，要特别注意引物 3’ 末端的序列。