问 题 可能原因 建议解决方法 RT-PCR 灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR 产物 RNA 被降解 在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA 使用良好的无污染技术分离RNA 在将组织从动物体取出后立刻处理 在100％甲酰胺中储存RNA 如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且，在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT。 RNA 中包含逆转录抑制剂 通过乙醇沉淀RNA 除去抑制剂。用70％（v/v）乙醇对RNA 沉淀进行清洗。可以加入糖元（0.25μg到0.4μg/μl）以帮助小量样品RNA 的恢复。 逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，亚精胺，甲酰胺和胍盐。 将对照RNA 同样品混合，同对照RNA 反应比较产量以检验抑制剂。

质粒快速鉴定 试剂： Protoplasting buffer: 30mM Tris-HCl, pH8.0 0.33ml/1.0M 5mM EDTA 0.1ml/0.5M 50mM NaCl 0.1ml/5.0M 20% Sucrose 5ml/40% 50 µ g/ml RNAseI 50ul/10mg/ml 50 µ g/ml lysozyme 50ul/10mg/ml 补水至10ml，-20℃分装保存。 Lysis buffer:

聚合酶链式反应（PCR ） 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR ）是体外酶促合成特异DNA 片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。典型的PCR 由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA 得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA 置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA 聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA 的新互补链。 PCR 能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA 片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA 混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA 片段。因此，PCR 技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆 和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基

用PCR 、GC发夹及变性梯度凝胶电泳检测突变 　　变性梯度胶凝电泳(DGGE)能够将具有单个碱基差别的DNA 分子分离开来。分离以 DNA 在溶液中的解链特性为基础。以温度或变性剂浓增高时，DNA 分子在不同的区域相 对应的解链温度称为基础。解链区域的长度从25个碱基对到数百个碱基对不等，与每 一个解链区域相对应的解链温度称为解链温度(Tm)。由于一个DNA 链上相邻碱基间的 堆积作用在DNA 双螺旋的稳定上起着相当重要的作用，因此解链区域的Tm值主要取决 于核苷酸的序列。既使是很小的变化也会引起DNA 片段Tm值的改变，如单碱基替代可 引起1.5℃的差异。在DGGE系统中，DNA 片段在变性剂梯度聚丙烯酰胺凝胶中电泳，凝 胶中自上而下所含变性剂浓度呈线性增加。DNA 片段在进入变性剂某一浓度时，此浓 度下DNA 片段在最低温度解链区域解链(相当于该区域的Tm值)，此时DNA 分子成分枝状 结构，它使DNA 分子在胶中的移动减慢。如果梯度条件选择恰当，因单个碱基变化使 不同的DNA 片段在凝胶中的不同位置分叉，随后DNA 片段移动减慢，从而使笪DNA 片段 最终分离开来。 　　DGG

幽门螺杆菌的基因诊断 　　早在19世纪未，就有注意到胃粘膜组织中存在一种螺旋形微生物，其后陆续有类似的报道，但均未引起人们的足够重视.1983年，澳大利亚学者Wanen和Marshall报告，在人胃粘膜活检组织中分离出这种细菌，即幽门螺杆菌(HelicobacterPYlor;HP;原名幽门变曲菌CampylobacterPylor;CP)，并认为该菌可能是慢性胃炎和消化性溃疡的病原菌.随后各国学者相继进行研究，欧洲九国成立了HP研究协作组，每年召开一次专题讨论会.美国、荷兰、加拿大、日本、等亦都主办过国际性专题讨论会.1990年在澳大利亚召开的第九届世界胃肠病学大会上，一个专题委员会对HP的研究现状进行了总结，基于HP研究后重大进展，产生了新的胃炎分类法--悉尼系统，我国于1985年开展HP的研究， 　　1987年在昆明召开的第三次全国消化系统病学术会议上有多篇HP的研究论文，随后逐渐形成了全国范围的研究高潮.有关HP是人类慢性胃炎的汉病因子，并与消化性溃疡和胃癌有密切关系已为大多数的摘要，抗HP感染治疗方案已成为HP相关疫病温床常用的治疗方案. 一、HP的流行病学与生物学特性.

PCR 在DMS/BMD基因诊断中的应用 　　DMD(Duchenne Muscular Dystrophy)和BMD(Becker Muscular Dystrophy)是一种常见的X连锁隐性遗传病，主要发生于男性，其发病率为1/3500活产男婴，其发生的原因是Dystrophin(抗肌萎缩蛋)其固缺陷所致. 一、DMD/BMD的临床表现 　　在临床上DMD较BMD常见，发病早，症状重，正常于2-3岁即出现骨骼肌无力的表现，一般从骨盒带肌肉无力开始而出现一系列的特殊症状:走路困难呈鸭步，出现Gower's征，腓肠肌进行性肥大.逐渐出现心肌细胞受损，约30%的小儿智能力缺陷.在12岁左右失去能力，至20岁时正常死于呼吸衰竭和心力衰竭.而BMD相对来说症状较轻，进展亦较慢. 二、DMD/BMD的遗传病 　　(一)遗传方式:X-连锁隐性遗传，发病者多为男性，其母亲为致癌基因携带者，尚有1/3的患者为散发病例，则新生突变引起. 　　(二)，DMD/BMD的致病基因:1.基因定位:DMD/BMD是因位于Xq21，其基因非常大约为2400Kb.2.基因结构:该基因共有79个外显子，78个内含

单纯疱疹病毒感染的诊断方法 　　单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)属于疱疹病毒科(herpes viridae).疱疹病毒科是一群中等大小的双链DNA病毒，有100个以上成员，根据理化性质分为α、β、γ三个疱疹病毒亚科.疱疹病毒感染的宿主范围极为广泛，可感染人类和其他脊椎动物，包括哺乳类、鱼类、两栖类、鸟类、有袋类等.疱疹病毒主要侵犯外胚层来源的组织，包括皮肤、粘膜和神经组织.疱疹病毒感染部位和引起的疾病多种多样，并有潜伏感伏的趋向，严重威胁人类健康. 人疱疹病毒的分类 　　侵犯人类的疱疹病毒有7种，即单纯疱疹病毒1型和2型(HSV-1，HSV-2)、水痘一带状疱疹病毒(Varicella-zostervirus，VZV)、巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)、人疱疹病毒6型(humanherpesvirus，HHV-6)和人疱疹病毒7型(HHV-7). 单纯疱疹病毒分子生物学研究 　　在过去十年中，由于分子生物技术的引入，使单纯疱疹病毒的研究在分子水平上取得了突破性的进

梅毒螺旋体感染的诊断方法 一、微生物流行病学概况及主要临床表现 　　梅毒(Syhillis)是由梅毒螺旋体(Treponema pallidum)引起的一种慢性全身性传染病.一经传染，螺旋体很快播散到全身，几乎可侵犯人体各器官，表现多种多样的类似很多疾病的临床表现，同时常时隐时现，病情变化难测，很容易造成误诊和漏诊.最早发现和论述梅毒病人的是在北美.一般认为梅毒起源于美洲.哥伦布的水手于1943年在北美染上梅毒后带回西班牙，很快在欧洲流行.后在交往中传到亚洲及世界各地，梅毒的传染途径有直接接触、间接接触和胎盘传染三种.直接接触传染又分为性直接接触和非性直接接触传染，其中性直接接触传染是梅毒传染的主要途径.此外，输血，特别是输入梅毒病人的新鲜血，也可以发生传染.一般根据梅毒传染途径不同，分为后天和先天梅毒.后天性(获得性)梅素是由皮肤或粘膜感染梅毒螺旋体而引起.其特点是症状反复出现，在疾病过程中也可以出现皮肤症状完全消退的潜伏期.根据其特点和经过，一般分为一期、二期和三期(晚期)梅毒.一期与二期梅毒传染性强，又称为早期梅毒，一般多在感染梅毒2年

A组轮状病毒感染的诊断 　　在腹泻病的病毒病因中，轮状病毒(Rotavirus简称RV)为主要病因，在经济发达国家，急性胃肠炎住院的婴幼儿中约1/3-1/2以上是轮状病毒腹泻，而在发展中国家，腹泻病每年造成500-1000万婴幼儿死亡，轮状病毒为主要病因，在我国，情况更加严重，我国不仅与世界其李国家要样遭受婴功儿(即A组)轮状病毒的危害，而且还受到成人腹泻轮状病毒Adult Diarrhea Rotavirus即ARV，B组)爆发流行的威胁。显然，我国比其他任何国家者更应当重视轮状病毒腹的研究。 (一)病毒特性 　　1.一般特性:RL属呼肠孤病毒科(reoviridae)中的一个属，1973年澳大利亚学者Bishop首先在婴幼儿急性腹泻的十二指肠超薄切片中发现其命名了由Elewett于1974提出，"Rota"在拉丁语为"车轮"，因此病毒在EMF状似车轮故名。RV完整颗粒为直经70nm左右的正二十面立华对称华，核心为一个分为11个节段的双链RNA(dSRNM)基因组(genome)，外面包有两层蛋白外壳。RV颗粒在粪便样本和细胞培养中以三种形式存在:一种是含有完整外壳的实宽心光滑型

PCR 技术在遗传病诊断中的应用 　　自从1985年PCR 技术首次应用于遗传病基因诊断以来，已有近百种遗传病可用PCR 技术进行诊断和产前诊断，利用PCR 技术诊断遗传病的途径有五个，①基因突变位点 的直接检出②筛查与遗传病③④有关的点突变③遗传多态性标记连锁分析间接诊断④ 利用cmRNA逆转录为cDNA进行分析或直接分析cmRNA. 　　传统的基因诊断技术主要是以基因探针技术为基础而建立的一些检测方法，包括 Southerninnouthern印迹杂交，RFLP为，它们可直接分析基因的缺失和重排，亦可利 用RFLP时行连锁分析，但由于这些技术操作繁琐，探针来源困难所需设剂昂贵，且要 用同抗素.完成一项诊断需要的时间亦较长，因此难于满足临床诊断的要求.限制了它 在临床上的应用.PCR 技术是一种在体外的海促DNA合成技术，它能在短时间内将靶DNA 扩增百万倍，而且操用简便，省时，准确性也高，它不仅能直检突变基因，而且可与 其它技术结合，使其诊断的准确性几达100%.而且不同同位素操作.能最大限度的满足 临床诊断的需要.因而它已成为目前遗传病诊断的产前诊断的主要手段. 一、PCR

PCR引物设计原则 PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。让我们先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。而且四种碱基的分布最好随机。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则P1引物设计的就不合理。应重新寻找区域设计引物。 同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。 引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第

个体配子DNA 序列的PCR分析 前言 　　高等生物遗传图谱的构建依赖于选择性杂交后代的分析或者通过家系分析法来计 算连锁关系。对人类而言仅后者是可行的。使用长度多态性限制片段（RFLPS）在构 建人连锁图谱方面已取得长足的进步。为了对带有与已知表现型相关的RFLP标记的基 因进行定位，首先得建立间隔约10CM的遗传标记束（平均1CM等于1％重组），这样没 有基因离标记RFLP的距离会超过5CM。可靠的统计表明家系分析能够检测的遗传间距 精确到1cM(1cM相当于1000kb的DNA 。分析更小的遗间距需要检测家族内大量的个体， 而这实际上是行不通的。 　　最近发展了一种不依赖遗传交叉或家系分析的方法检测遗传标记间的重组频率。 具体方法是直接决定配子(精子)的基因型是亲本型还是重组型。这通过确定两个等位 基因中哪一个存在于双杂合男性精子上的两个基因座点其中之一来完成。根据上述方 法确定的重组精子的数量被总检测精子数除就可估计出重组频率。已知聚合酶反应在 体外扩增基因能够使DNA 扩增109 倍，因此该技术有可能分析精子中单分子靶DNA 。以 这种方式研究数千个人精子就有可能构建比家

RFLP－－限制片段长度多态性 限制性片段长度多态性（RFLP，Restriction Fragment Length Polymorphism） 　　RFLP技术于1980年由人类遗传学家Bostein提出。它是第一代DNA分子标记技术。Donis―Keller利用此技术于1987年构建成第一张人的遗传图谱。DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限制片段长度多态性)已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。所用的探针为来源于同种或不同种基因组DNA的克隆，位于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记(Mark)，构建分子图谱。当某个性状（基因）与某个（些）

PCR基础 聚合酶链式反应（PCR）过程利用模板变性，引物退火和引物延长的多个循环来扩增DNA序列。这是一个指数增长的过程，因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，使其成为检测核酸的一种非常灵敏的技术。一般，经过20-30个循环得到的扩增产物就足够在溴化乙锭染色的凝胶上观察到。反应包括几个成分（表1）。模板可以为纯化的基因组或质粒DNA；由 RNA 转化得到的cDNA；或未经纯化的粗制生物样品，如细菌克隆或噬菌斑。引物确定了扩增产物的序列和长度。最常用的热稳定聚合酶是Taq DNA聚合酶。这种酶适用于常规扩增，但是使用其他热稳定聚合酶会改善结果。扩增反应还包括缓冲液，三磷酸脱氧核苷及镁离子。镁离子浓度影响酶的活性、引物退火、模板和PCR产物的熔点（Tm），忠实性以及引物二聚体的形成等。在随后的章节中将讨论这些成分、循环参数以及其他参与作用的因子相互间各种作用对于成功PCR的影响。 表1. 反应成分 Component Final Concentration Template

一、质粒 DNA 的提取及鉴定 　　（一）质粒 DNA 的提取及鉴定 1．收获细菌 （1）将2ml含相应抗生素的LB液体培养基加入到通气良好的15ml的试管中，接入一单菌落，于37℃剧烈振荡培养过夜。 （2）将1.5ml培养物倒入1.5ml离心管中，用台式离心机于4℃以12000g离心5min，将剩余的培养物贮存于4℃。 （3）吸尽培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。 2．碱裂解法小量抽提质粒 （1）将细菌沉淀[上述步骤（3）所得]重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ（50mmol/L葡萄糖，25mmol/l Tris –HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA）中，剧烈振荡。 （2）加200μl新配制的溶液Ⅱ（0.2mol/l NaOH, 1%SDS），缓和振荡，水浴5min。 （3）加150μl预冷溶液Ⅲ（50mol/L KAC 60ml, 冰乙酸11.5ml,水28.5ml），缓和振荡，冰浴5min。 （4）4℃以12000g离心5min，将上清转移到另一离心管中。 （5）可作不可作：加等量

甲基化研究对于基因的 调控和肿瘤的发生有非常密切的关系。在一般正常的细胞中，基因调控区CpG岛处于非甲基化的状态。而当细胞发生癌变后，这些CG区域往往呈现甲基化状态。英国医学刊物《the Lancet》报道奥地利因斯布鲁克医学院的专家们早就可以通过检测大便中 DNA 的甲基化变化，把健康人的大便与结肠癌患者的大便区分开。大便标本中SFRP2 甲基化的程度是诊断结肠癌最灵敏的标记。研究人员发现，肿瘤的发生以及一些遗传病的出现和基因甲基化有非常密切的关系。目前 DNA 甲基化研究是肿瘤分子生物学研究的一个重要领域。 Pyrosequencing技术作为一种新的序列分析技术，能够快速地检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进行定性及定量检测，为甲基化研究提供了新的途径。Pyrosequencing是一种通过合成方法进行序列分析的方法，它通过核苷酸和模板结合后释放的焦磷酸引发酶级联反应，促使荧光素发光并进行检测。这项技术曾经被用作单核苷

樟目（Laurales） 本目包括樟科、蜡梅科、金粟兰科（Chloranthaceae）等9科，樟目是由木兰目起源较进化的类群，表现在花部定数、轮状排列，3基数，雄蕊花丝明显，心皮结合，胚珠少数等。 樟科(Lauraceae，Laurel Family） 本科约5０属，2５00余种，分布于亚洲和美洲热带和亚热带，主要产地为东南亚和巴西。我国产20属，400多种，多产于长江流域及其南部诸省、区，为我国亚热带常绿阔叶林的重要组成成分，其中有许多是优良木材、芳香油原料及药材。 科的特征 常绿或落叶木本，仅无根藤属(Cassytha)是无叶寄生缠绕藤本。叶及树皮有含芳香油或樟脑的油细胞。单叶互生，通常全缘，三出脉或羽状脉，无托叶。圆锥花序、总状花序或头状花序；花两性或单性，辐射对称，花各部轮状排列，多3基数；花被片6(4)枚，两轮；雄蕊9或12，花药瓣裂；子房上位，3心皮合生1室1胚珠。核果或浆果，种子无胚乳。染色体：X=7,12。花粉无萌发孔。 本科的分类主要依据花序类型、花两性或单性、花被片在花后是宿存还是脱落、第三轮雄蕊花药内向或外向、花药

毛茛目（Ranunculales） 本目包括毛茛科、罂粟科、小檗科(Berberidaceae)、大血藤科(Sargentodoxaceae)、木通科(Lardizabalaceae)、防己科(Menispermaceae)等7科，这些科大多保持着离生的心皮，和木兰目有着明显的亲缘关系。从形态性状和分子性状（rbcL, atpB, 18S等）推测该目是单系的，被置于真双子叶植物群的最基部。 毛茛科(Ranunculaceae，Crowfoot Family） 本科被认为是双子叶植物中较原始的一个草本类群。广义的毛茛科包括芍药属(Paeonia)。但由于该属心皮厚革质，花有花盘，雄蕊离心发育，具外珠被，染色体X=5，含有芍药甙等与本科其它属明显不同，而单立一科（Paeoniaceae），置于虎耳草目(Saxifragales)。约50属，近2000种，广布于世界各地，多见于北温带与寒带。我国约41属，700种，分布全国各地。本科有许多经济植物，尤以药用植物较多，有些可作观赏植物，有一些则为有毒植物。 科的

心草目（Juncales） 本目包括莎草科、灯心草科（Juncaceae）等4科。在以往的系统中莎草科大多单立莎草目，也有与禾本科共同组成莎草目（如Cronqist系统）。因与灯心草科（Juncaceae）均具秆实心、叶3列、无草酸钙结晶、染色体具弥散式着丝点等特征，Judd等人将莎草科置于灯心草目。 莎草科（Cyperaceae，Sedge Family) 本科为广布全球的一个草本大科，约120属4500多种，主产温带地区。我国有28属500多种，分布全国各地。其经济意义不及禾本科重要，但荸荠可作水果或蔬菜，有些植物可药用或供编织草席等用，然而有不少为农田杂草。 科的特征 多年生，少为一年生草本，常具根茎；地上茎（秆）多为三棱形，实心；叶基生或秆生，常排成3列；叶片条形，基部叶鞘闭合，或叶片退化而仅具叶鞘。花小，2~多朵集成小穗，单一或再排成各种花序，花序下通常有1~多枚叶状、刚毛状或鳞片状总苞片；花两性或单性，生于鳞片（颖片）的腋内，鳞片在小穗轴上2列或螺旋状排列；花被缺或

槟榔目（Arecales） 本目仅有槟榔科。以往大多与天南星科等共同组成槟榔亚纲，而Judd系统则置于鸭跖草类中。 槟榔科（Arecaceae, Palm Family） 本科常称为棕榈科（Palmae），约200属，2780种，主产美洲和亚洲热带；我国约有20属70余种，主产华南。本科是热带森林景观的重要组成部分，许多种类也是热带地区重要的经济植物。 科的特征 常绿乔木或灌木，稀为藤本，茎常不分枝。叶互生，集生茎顶部，大形，掌状分裂或羽状分裂，芽时折叠，叶柄基部常扩大成纤维状的鞘。花组成分枝或不分枝的肉穗花序，外有1~至数枚佛焰苞状总苞；花两性或单性，雌雄同株或异株；花被、雄蕊均为6，分离或合生；子房上位，1~3室，每室1胚珠。核果或浆果，外果皮肉质或纤维质。染色体X=13~18，花粉2核，多数具单沟。 本科分类主要依据茎直立还是攀援、叶分裂方式、花两性或单性、花被和雄蕊分离或合生、果实类型等性状。 棕榈属(Trachycarpus) 常绿乔木，叶掌状分裂；花常单性，雌雄异株；花序为多分枝的肉穗花序或圆锥花序；花被基部