从分离到表达 不同的抗体重组技术可以用于制备不同的抗体，工业上和学术界都发展了许多相关的技术，噬菌体展示就是其中的主导技术。昆虫和哺乳动物细胞的表达系统从理论上而言是相似的，但是其它的分子进化类型需要重新提炼和分离抗体。 剑桥抗体技术（Cambridge Antibody Technologies）和其它研究单位的大规模抗体库的筛选通常都是一些方法组合，例如噬菌体展示和核糖体展示组合，进一步提高抗体的亲和力。 然而，较少的抗体库能通过商业途径获得，因为知识产权从某种程度山而言已经阻碍了该技术的发展。 噬菌体展示 噬菌体展示技术就是将天然免疫和获得性免疫个体中分离的抗体基因插进噬菌体DNA中。抗体分子包括抗体的可变区域，该区域能与抗原结合，称作scFv，被连接到噬菌体衣壳蛋白上。噬菌体感染大肠杆菌后，单链DNA在宿主内复制，并且噬菌体重新组装，分泌到培养基中去，同时不会裂解宿主大肠杆菌。噬菌体与靶标抗原孵育，结合上去的噬菌体分离后，扩增，纯化。这种方法能轻易的筛选大量的克隆。 核糖体展示 该技

免疫血清--immune serum 免疫血清（immune serum）亦称抗血清。含有抗体的血清制剂。种类很多，包括抗毒素、抗菌血清、抗病毒血清、抗Rh血清等。（1）抗毒素，将类毒素多次免疫动物（常用马）后，采取动物的免疫血清，经浓缩纯化后制得。主要用于治疗细菌外毒素所致疾病。常用的有白喉抗毒素、破伤风抗毒素。（2）抗菌血清，在本世纪40年代以前曾用抗肺炎、抗百日咳、抗炭疽等抗菌血清治疗有关疾病。自从磺胺类药物和抗生素大量应用后，已极少应用于临床治疗。但对一些耐药菌株引起的感染，可用抗菌血清治疗。如对绿脓杆菌引起的感染的治疗。（3）抗病毒血清，用病毒免疫动物，取其血清精制而成。目前对病毒病的治疗尚缺乏特效药物。故在某些病毒病的早期或潜伏期，可考虑用抗病毒血清治疗。如用抗狂犬病毒血清与抗狂犬疫苗同时对被狂犬严重咬伤者进行注射，可防止狂犬病的发生。生。（4）抗Rh血清，能作用于Rh阳性（Rh+ ）红细胞，临床上常用提纯的抗Rh球蛋白预防Rh新生儿溶血症（见Rh免疫球蛋白）。 上一篇：免疫血清的制备及免疫球蛋白的

（一）组织鉴定（ histological identification ） 　　组织鉴定是通过观察植（动）物器官的各种切片，以生药的组织构造 、细胞 形状和内含物形态等特征来鉴定生药的真伪。用于完整药材或能够满足制作切片条件的饮片的鉴定。组织鉴定适于药材性状特征难区别或外形相似而组织构造不同的类似品、混淆品、代用品、伪品，或用于同属多来源药材的对比鉴别。一般来说，组织鉴定对不同科属来源的药材鉴别比较容易，对于相同科属来源的药材鉴别相对较困难。 （二）粉末鉴定 (powder identification) 　　粉末鉴定是通过生药的粉末制片，观察生药的细胞 、内含物形态特征来鉴定生药的真伪。通常用于粉末药材、外形较大或组织构造无鉴别特征的药材、破碎药材以及粉末性的中成药的鉴别。 （三）显微化学反应 (micro-chemcal reaction) 　　显微化学反应是将生药的干粉、手切片或浸出液少量，置于载玻片上，滴加某些化学试剂使产生沉淀或结晶，或产生特殊的颜色，在显微镜下观察反应结果，从而进行鉴定。显微化学反应主要用于

β细胞移植和抑制免疫反应 虽然胰岛素治疗糖尿病自从上个世纪20年代就开始使用，但是胰岛素并不能完全治愈糖尿病，并且有很多复杂的并发症。但是从70年代开始的研究发现β细胞能够完全补充移植后的葡萄糖水平，使患者体内的葡萄糖水平维持动态平衡。从尸体获得的胰腺移植到患者体内一直不能成功，直到2000年，肾上腺皮质激素的应用改良了移植的免疫排斥反应，胰腺的移植才成为治疗糖尿病的手段之一。这极大地增强了全世界糖尿病患者和医学研究人员对糖尿病医治的信心。 由于用于移植的腺体和β细胞来源有限，远远不能满足全世界上百万的1型糖尿病患者。有很多的政府或私人机构如BCBC(http://www.betacell.org )也致力于寻找新的能替代β细胞的细胞资源。多种细胞都被考虑用于细胞治疗中，如胚胎干细胞，肝细胞，腺体内产生的干细胞，因为干细胞能分化成各种组织细胞，当然也包括能特异的分化成β细胞，但如何调控使其分化成特定的β细胞还不知道。在临床的应用还有很长的路要走。 近来，治疗糖尿病的研究主要集中在成熟β细胞上面，因为，在健康啮齿动物中的β细胞是能够大量的自我繁殖，包括胰腺管细

荧光原位杂交介绍 荧光原位杂交方法是一种物理图谱绘制方法，使用荧光素标记探针，以检测探针和分裂中期的染色体或分裂间期的染色质的杂交。 荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术,以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法,探针首先与某种介导分子(reporter molecule)结合,杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料[1,2].FISH的基本原理是将DNA(或RNA)探针用特殊的核苷酸分子标记,然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上,再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析.FISH具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点,不但能显示中期分裂相,还能显示于间期核.同时在荧光原位杂交基础上又发展了多彩色荧光原位杂交技术和染色质纤维荧光原位杂交技术. 对于利用rRNA的荧光原位杂交来说

免疫血清的制备及免疫球蛋白的提取 实验题目 ：免疫血清的制备及免疫球蛋白的提取 教 师：XXX 实验类型： 基础 学　　时 ：12(参考) 内　　容 ： 一、实验目的 ： 1.理解免疫血清的来源及主要成份。 2.掌握制备抗特定抗原的动物抗血清的方法。 3.掌握免疫球蛋白的提取过程。 二、实验原理 ： 免疫血清的制备是利用动物，有目的地生产某种抗体，通过这种方法得到的抗体是多克隆抗体，可用于体外的抗原抗体反应。 通过对正常健康兔子免疫注射通过免疫佐剂处理的外源抗原，多次免疫后使兔子产生针对此抗原的特异性抗体，通过离心得到的血清就是抗特定抗原的动物抗血清。 硫酸氨分级沉淀后使用阴离子交换柱纯化出来免疫球蛋白。 三、试剂与器材 ： 1.实验动物：兔子 2.抗原：（小牛血清） 3.佐剂：福氏完全佐剂 4.乳化搅拌器 5.注射器及针头 6.手术器械：剪刀，手术刀，线，血管钳，塑料导管 7.离心机及离心管 8.三角瓶 9.酒精棉球 10. Na2 N3 四、操

FISH 荧光原位杂交图象分析系统 产品性能 ： 安莱公司自1994年就开始在中国大陆推广染色体图像分析系统。是中国大陆的先驱。 安莱公司推过近十年的推广，培养了一批技术过硬的客户服务队伍，来帮助顾客选择仪器，组建实验室等工作。现在由香港自然基因有限公司继续跟进. 荧光原位杂交（FISH）图像分析软件和专业图像数据库软件VideoTesT-FISH Analytics Software (荧光原位杂交图像分析软件) VideoTesT Album3.0 Image Database Software （专业图像数据库软件） 1） 用于人、动物和植物等各种不同生物的中期分裂相和间期细胞的FISH图像分析；包括：  染色体异常综合征（额外小染色体、微缺失或重复等）  染色体涂染（chromosome painting）  基因或DNA片段的染色体定位  标记染色体（白血病、实体肿瘤等）  分子病理学（组织切片）  细胞涂片（绒毛、精子、卵裂球PGD等）  脱落细胞收集制片（羊水等）。 2） 标式功能框，操作简便； 3）

本文根据华东理工大学生物工程学院的酶工程课件整理而成 一、实验流程 二、实验安排 第1次 菌体超声破壁、离心、包涵体复性、 装离子交换柱 第2次 测酶活、定蛋白离子交换层析 层析样品进行浓缩、透析 第3次 浓缩、透析前、后样品测活、定蛋白 装分子筛柱 第4次 分子筛层析，并对收集样品进行测活、定蛋白等 第5次 对分离纯化各样品进行蛋白电泳分析，并绘出分离纯化表 三、实验操作 第1次： 菌体超声破壁、离心、包涵体复性、装离子交换柱 实验顺序：超声破壁→离心→装离子交换柱→平衡→包涵体复性 掌握要点：破壁原理 装离子交换柱方法 包涵体复性原理及方法 第2 次：测酶活、定蛋白、 离子交换层析分析 、 层析样品进行浓缩、透析 实验顺序：测酶活→上柱→梯度洗脱→定蛋白→紫外吸收测蛋白峰→酶活曲线测定→收集样品→ 浓缩 →透析 涉及单元实验：测酶活、定蛋白、 离子交换层析、浓缩、透析 掌握要点：碱

冷泉港实验室：RNA i基因沉默方法 大约在十年前，2006年诺贝尔生理/医学奖得主CraigMello和AndrewFire发现，他们能够将短RNA 分子插入到线虫中并沉默特定基因的表达。今天，研究人员也常常使用这种强大的RNA 干扰方法来研究哺乳动物系统中的特定基因功能。 　　为了进行这种基因沉默实验，研究人员通常需要依赖化学合成的RNA 分子，而这个合成过程是相当昂贵的。本月《冷泉港实验手册》（ColdSpringHarborProtocols）上的一篇免费文章就这个问题进行了讨论。该文章描述了一种能产生沉默RNA （esiRNA ）以有效靶向哺乳动物细胞中的任何基因的很划算的方法。 　　这篇文章（http://www.cshprotocols.org/cgi/content/full/2007/16/pdb.prot4824 ,）描述了如何在体外利用酶合成RNA 分子，该方法利用克隆的感兴趣基因作为模版。接着，这些RNA 分子被随机分割成短的片段，纯化后用于RNA 干扰实验。 　　这种方法是由德国马

信号通路，只有一个目的：将细胞的外部信号转换成细胞的内部变化。不管是胰岛素，还是异亮氨酸，抗原还是肾上腺素，它们的终极目的总是如出一则：对转录活性的改变。 这些对于转录活性的影响来自于转录因子与基因的调控区域：如启动子、增强子、沉默子等结合达到的。经典的凝胶迁移滞后试验（the electrophoretic mobility shift assay）已经成为证明某种蛋白能与特定的短基因序列结合的有力方法手段。但是凝胶迁移滞后试验具有速度慢，通量低，不定量和具有放射性的特点。即使完了你还不知道究竟是何种蛋白或者是蛋白的何种基团负责指导体内转录的变化。 为了弄清楚蛋白与基因序列结合的精确位点，需要利用基于抗体的实验。目前已经有了一些方便快捷的分析试剂，可以有力的帮助进行转录研究分析，其中有一些适用于发现型（筛选多种因子），有一些用于证实猜想的。当然这些总是从初期的工作，进入精细进一步的研究工作。 PROTEIN ARRAYS（蛋白芯片） What they are：固定的转录因子阵列，利用标记的基因序列或者蛋白质进行探索。

问 题 可能原因 建议解决方法 RT-PCR 灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR 产物 RNA 被降解 在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA 使用良好的无污染技术分离RNA 在将组织从动物体取出后立刻处理 在100％甲酰胺中储存RNA 如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且，在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT。 RNA 中包含逆转录抑制剂 通过乙醇沉淀RNA 除去抑制剂。用70％（v/v）乙醇对RNA 沉淀进行清洗。可以加入糖元（0.25μg到0.4μg/μl）以帮助小量样品RNA 的恢复。 逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，亚精胺，甲酰胺和胍盐。 将对照RNA 同样品混合，同对照RNA 反应比较产量以检验抑制剂。

质粒快速鉴定 试剂： Protoplasting buffer: 30mM Tris-HCl, pH8.0 0.33ml/1.0M 5mM EDTA 0.1ml/0.5M 50mM NaCl 0.1ml/5.0M 20% Sucrose 5ml/40% 50 µ g/ml RNAseI 50ul/10mg/ml 50 µ g/ml lysozyme 50ul/10mg/ml 补水至10ml，-20℃分装保存。 Lysis buffer:

聚合酶链式反应（PCR ） 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR ）是体外酶促合成特异DNA 片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。典型的PCR 由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA 得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA 置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA 聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA 的新互补链。 PCR 能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA 片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA 混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA 片段。因此，PCR 技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆 和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基

用PCR 、GC发夹及变性梯度凝胶电泳检测突变 　　变性梯度胶凝电泳(DGGE)能够将具有单个碱基差别的DNA 分子分离开来。分离以 DNA 在溶液中的解链特性为基础。以温度或变性剂浓增高时，DNA 分子在不同的区域相 对应的解链温度称为基础。解链区域的长度从25个碱基对到数百个碱基对不等，与每 一个解链区域相对应的解链温度称为解链温度(Tm)。由于一个DNA 链上相邻碱基间的 堆积作用在DNA 双螺旋的稳定上起着相当重要的作用，因此解链区域的Tm值主要取决 于核苷酸的序列。既使是很小的变化也会引起DNA 片段Tm值的改变，如单碱基替代可 引起1.5℃的差异。在DGGE系统中，DNA 片段在变性剂梯度聚丙烯酰胺凝胶中电泳，凝 胶中自上而下所含变性剂浓度呈线性增加。DNA 片段在进入变性剂某一浓度时，此浓 度下DNA 片段在最低温度解链区域解链(相当于该区域的Tm值)，此时DNA 分子成分枝状 结构，它使DNA 分子在胶中的移动减慢。如果梯度条件选择恰当，因单个碱基变化使 不同的DNA 片段在凝胶中的不同位置分叉，随后DNA 片段移动减慢，从而使笪DNA 片段 最终分离开来。 　　DGG

幽门螺杆菌的基因诊断 　　早在19世纪未，就有注意到胃粘膜组织中存在一种螺旋形微生物，其后陆续有类似的报道，但均未引起人们的足够重视.1983年，澳大利亚学者Wanen和Marshall报告，在人胃粘膜活检组织中分离出这种细菌，即幽门螺杆菌(HelicobacterPYlor;HP;原名幽门变曲菌CampylobacterPylor;CP)，并认为该菌可能是慢性胃炎和消化性溃疡的病原菌.随后各国学者相继进行研究，欧洲九国成立了HP研究协作组，每年召开一次专题讨论会.美国、荷兰、加拿大、日本、等亦都主办过国际性专题讨论会.1990年在澳大利亚召开的第九届世界胃肠病学大会上，一个专题委员会对HP的研究现状进行了总结，基于HP研究后重大进展，产生了新的胃炎分类法--悉尼系统，我国于1985年开展HP的研究， 　　1987年在昆明召开的第三次全国消化系统病学术会议上有多篇HP的研究论文，随后逐渐形成了全国范围的研究高潮.有关HP是人类慢性胃炎的汉病因子，并与消化性溃疡和胃癌有密切关系已为大多数的摘要，抗HP感染治疗方案已成为HP相关疫病温床常用的治疗方案. 一、HP的流行病学与生物学特性.

PCR 在DMS/BMD基因诊断中的应用 　　DMD(Duchenne Muscular Dystrophy)和BMD(Becker Muscular Dystrophy)是一种常见的X连锁隐性遗传病，主要发生于男性，其发病率为1/3500活产男婴，其发生的原因是Dystrophin(抗肌萎缩蛋)其固缺陷所致. 一、DMD/BMD的临床表现 　　在临床上DMD较BMD常见，发病早，症状重，正常于2-3岁即出现骨骼肌无力的表现，一般从骨盒带肌肉无力开始而出现一系列的特殊症状:走路困难呈鸭步，出现Gower's征，腓肠肌进行性肥大.逐渐出现心肌细胞受损，约30%的小儿智能力缺陷.在12岁左右失去能力，至20岁时正常死于呼吸衰竭和心力衰竭.而BMD相对来说症状较轻，进展亦较慢. 二、DMD/BMD的遗传病 　　(一)遗传方式:X-连锁隐性遗传，发病者多为男性，其母亲为致癌基因携带者，尚有1/3的患者为散发病例，则新生突变引起. 　　(二)，DMD/BMD的致病基因:1.基因定位:DMD/BMD是因位于Xq21，其基因非常大约为2400Kb.2.基因结构:该基因共有79个外显子，78个内含

单纯疱疹病毒感染的诊断方法 　　单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)属于疱疹病毒科(herpes viridae).疱疹病毒科是一群中等大小的双链DNA病毒，有100个以上成员，根据理化性质分为α、β、γ三个疱疹病毒亚科.疱疹病毒感染的宿主范围极为广泛，可感染人类和其他脊椎动物，包括哺乳类、鱼类、两栖类、鸟类、有袋类等.疱疹病毒主要侵犯外胚层来源的组织，包括皮肤、粘膜和神经组织.疱疹病毒感染部位和引起的疾病多种多样，并有潜伏感伏的趋向，严重威胁人类健康. 人疱疹病毒的分类 　　侵犯人类的疱疹病毒有7种，即单纯疱疹病毒1型和2型(HSV-1，HSV-2)、水痘一带状疱疹病毒(Varicella-zostervirus，VZV)、巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)、人疱疹病毒6型(humanherpesvirus，HHV-6)和人疱疹病毒7型(HHV-7). 单纯疱疹病毒分子生物学研究 　　在过去十年中，由于分子生物技术的引入，使单纯疱疹病毒的研究在分子水平上取得了突破性的进

梅毒螺旋体感染的诊断方法 一、微生物流行病学概况及主要临床表现 　　梅毒(Syhillis)是由梅毒螺旋体(Treponema pallidum)引起的一种慢性全身性传染病.一经传染，螺旋体很快播散到全身，几乎可侵犯人体各器官，表现多种多样的类似很多疾病的临床表现，同时常时隐时现，病情变化难测，很容易造成误诊和漏诊.最早发现和论述梅毒病人的是在北美.一般认为梅毒起源于美洲.哥伦布的水手于1943年在北美染上梅毒后带回西班牙，很快在欧洲流行.后在交往中传到亚洲及世界各地，梅毒的传染途径有直接接触、间接接触和胎盘传染三种.直接接触传染又分为性直接接触和非性直接接触传染，其中性直接接触传染是梅毒传染的主要途径.此外，输血，特别是输入梅毒病人的新鲜血，也可以发生传染.一般根据梅毒传染途径不同，分为后天和先天梅毒.后天性(获得性)梅素是由皮肤或粘膜感染梅毒螺旋体而引起.其特点是症状反复出现，在疾病过程中也可以出现皮肤症状完全消退的潜伏期.根据其特点和经过，一般分为一期、二期和三期(晚期)梅毒.一期与二期梅毒传染性强，又称为早期梅毒，一般多在感染梅毒2年

A组轮状病毒感染的诊断 　　在腹泻病的病毒病因中，轮状病毒(Rotavirus简称RV)为主要病因，在经济发达国家，急性胃肠炎住院的婴幼儿中约1/3-1/2以上是轮状病毒腹泻，而在发展中国家，腹泻病每年造成500-1000万婴幼儿死亡，轮状病毒为主要病因，在我国，情况更加严重，我国不仅与世界其李国家要样遭受婴功儿(即A组)轮状病毒的危害，而且还受到成人腹泻轮状病毒Adult Diarrhea Rotavirus即ARV，B组)爆发流行的威胁。显然，我国比其他任何国家者更应当重视轮状病毒腹的研究。 (一)病毒特性 　　1.一般特性:RL属呼肠孤病毒科(reoviridae)中的一个属，1973年澳大利亚学者Bishop首先在婴幼儿急性腹泻的十二指肠超薄切片中发现其命名了由Elewett于1974提出，"Rota"在拉丁语为"车轮"，因此病毒在EMF状似车轮故名。RV完整颗粒为直经70nm左右的正二十面立华对称华，核心为一个分为11个节段的双链RNA(dSRNM)基因组(genome)，外面包有两层蛋白外壳。RV颗粒在粪便样本和细胞培养中以三种形式存在:一种是含有完整外壳的实宽心光滑型

PCR 技术在遗传病诊断中的应用 　　自从1985年PCR 技术首次应用于遗传病基因诊断以来，已有近百种遗传病可用PCR 技术进行诊断和产前诊断，利用PCR 技术诊断遗传病的途径有五个，①基因突变位点 的直接检出②筛查与遗传病③④有关的点突变③遗传多态性标记连锁分析间接诊断④ 利用cmRNA逆转录为cDNA进行分析或直接分析cmRNA. 　　传统的基因诊断技术主要是以基因探针技术为基础而建立的一些检测方法，包括 Southerninnouthern印迹杂交，RFLP为，它们可直接分析基因的缺失和重排，亦可利 用RFLP时行连锁分析，但由于这些技术操作繁琐，探针来源困难所需设剂昂贵，且要 用同抗素.完成一项诊断需要的时间亦较长，因此难于满足临床诊断的要求.限制了它 在临床上的应用.PCR 技术是一种在体外的海促DNA合成技术，它能在短时间内将靶DNA 扩增百万倍，而且操用简便，省时，准确性也高，它不仅能直检突变基因，而且可与 其它技术结合，使其诊断的准确性几达100%.而且不同同位素操作.能最大限度的满足 临床诊断的需要.因而它已成为目前遗传病诊断的产前诊断的主要手段. 一、PCR