方法一 1. 试剂与配制 蛋白酶K：20mg/L 溶于10mmol/L Tris-HCl pH7.5 TE缓冲液（pH7.5 或8.0） PBS（磷酸盐缓冲液） 钾缓冲液：50mmol/L KCl,10～20mmol/L Tris-Cl，2.5mmol/L MgCl(pH8.3)，1%laureth12 ，0.5% Tween-20，蛋白酶K（100μg/ml） 2.操作方法 ① 通过密度梯度离心法，分离1～2ml全血中的单核细胞； ② 用PBS缓冲液洗单核细胞2次，然后计数； ③ 用100μl钾缓冲液悬起部分细胞，使其浓度为5000个/μl； ④ 56℃水浴45min，消化细胞； ⑤ 95℃ 保温10min，灭活蛋白酶K，取10μl上清进行100μl PCR反应。 方法二 1. 试剂与配制 1%SDS，10mmol/L EDTANa2 玻璃粉悬液（50%水溶液） 乙醇漂洗液：50%乙醇，10mmol/L Tris-Cl（pH7.4），1mmol/L EDTA，50mmol/L NaCl 2. 操作方法 ① 将

此方法适用于各种拭子标本（鼻、咽、口腔和生殖道等）中DNA的快速制备。 试剂与配制 PBS-2×Fungi-Bact液；生理盐水；无水乙醇；TE缓冲液；钾缓冲液：50mmol/L KCl，10～20mmol/L Tris-Cl，2.5mmol/L MgCl(pH8.3)，1%laureth12，0.5% Tween-20，蛋白酶K（100μg/ml）； 操作方法 一、采样： 1. 用无菌生理盐水润湿消毒的棉签蘸取鼻、咽、口腔和生殖道等表面的上皮或感染的表面，将沾有标本的棉签置于2mlPBS-2×Fungi-Bact液中。如样本在24 hr内处理，可室温保存，否则存于4℃； 2. 动物组织用生理盐水漂洗一次，切成宽度小于1cm的小片，用等体积的生理盐水悬起，边摇边加入无水乙醇至终浓度为50%，室温下可保存数日，4℃可保存数年； 3. 肝素或柠檬酸抗凝血室温保存1～2d后仍能进行DNA分析，保存用于DNA分析的血样品的较理想的，也是最简单的方法就是将血涂于玻片上干燥保存。100μl血涂片含有5×105 个细胞，相当于3μg哺乳动物细胞核DNA。 二、D

固定和包埋的组织标本DNA PCR反应模板的制备 石蜡包埋组织和其他固定组织代表档案标本。由于PCR可以扩增相对于完整的染色体DNA来说较短的DNA片段，而且在一定程度上可接受降解的DNA，所以固定组织适用于分子遗传学研究。这些组织是前瞻和回顾性分子遗传学和感染疾病研究的巨大资源。大部分固定和包埋组织标本经福尔马林固定，分析前样品大多要进行脱蜡和水化，再用蛋白酶消化。 【试剂与配制】 （1）辛烷或二甲苯 （2）丙酮 （3）无水乙醇 （4）消化缓冲液：50mmol/L Tris-Cl(pH8.5)， 1mmol/LEDTA， 0.5%Tween20，20mg/ml蛋白酶K 【操作方法】 方法一：由石蜡块制备DNA 1． 脱蜡：组织切片一般5～10μm厚。用同一切片机切不同标本时，应注意标本间的交叉污染。应在两次操作间用二甲苯认真搽洗刀片、镊子和任何可能污染的部位。 每片切片用一小镊子夹入微量离心管中，按下法进行脱蜡。 （1） 加1ml辛烷或二甲苯于微量离心管中，盖紧盖后室温作用30min； （2）

免疫PCR(IM-PCR)注意事项 (1)固相载体的选择：主要取决于抗原在固相载体上的吸附程度。如果抗原吸附良好，可以进行IM-PCR。如果抗原吸附不良，则需选用双抗体夹心IM―PCR。另外选用的固相载体要和PCR仪器相匹配。一般用0.5ml的塑料反应管，也可以用微量滴定板。 (2)待检抗原的特异性抗体：这是决定本法特异性和敏感性的关键试剂，使用相应的McAb为宜。将抗体进行生物素标记后，可用于直接IM―PCR，或以生物素化的二抗来连接亲合素和生物素化DNA分子，用于间接IM―PCR。 (3)连接分子：用于连接两个不同的分子，在IM―PCR中，就是把作为模板的DNA标记分子连接到目的物(例如抗原)上去。并且要求此种连接是特异的，高亲和性的。为此，常用生物素及其结合蛋白―亲合素或链霉亲合素作为连接分子。只要将需要连接的分子标以生物素，就可以通过亲合素将它们连接起来。Sano等(1992)用的是重组的链霉亲合素与A蛋白的嵌合体，它一方面可借亲合素与生物素化DNA分子(质粒)相结合，另一方面可以通过A蛋白与所测抗原的相应抗体

PCR 在淋巴细胞抗原受体研究中的应用 T细胞识别各种抗原，是依靠细胞表面的T细胞受体复合物(TCR)。TCR是由4条多肽链(α.β.γ.δ)组成，每条链由相应的基因编码，其基因是由高变区(V)，多样区(D)，连接区(J)和恒定区(C)组成。由于不同的V―D―J重排，使PCR产生多样性和特异性。经PCR扩增可以检测细胞单克隆基因重排，同样，免疫球蛋白(Ig)重链基因重排是产生抗体多样性和特异性的主要机理。不同的B细胞克隆可发生不同类型的重链基因重排，Ig重链可变区的多样性源于其基因的可变区，多样区和连接区的重排结果。可变区基因的可变性集中在三个区域，被4个序列保守框架区(FR1―4)所分割。由于这三个高可变区决定着抗体与抗原的结合部位，因此被称为互补决定区(CDR)，其中第三个互补决定区(CDR3)含有几乎所有V―D―J信息，可变性较高，可以代表细胞基因重排克隆标志。 采用PCR方法检测基因重排的基本策略是针对已知的发生V―D―J重排的不同方式而设计出1对或多对相应的引物，进行一次或数次PCR扩增。将扩增产物直接测序或酶切及电泳分析，即

应用PCR扩增T细胞受体基因重排 【操作方法】 （1） 引物设计：引物1～11是用于PCR的引物,其目的是扩增目的基因和分离特异性探针,分别适用于Vδ1-D1-Jδ1重排和Vδ2-Dδ3重排的检测。见表。引物4中用G#取代野生型A,产生限制性内切酶Fok1位点。 表 扩增TCR基因重排PCR引物 ──────────────── (1) 5’-GTGTGTATTTGTGGCCTTCA-3’ (2) 5-’ACTCAAGCCCAGTCATGAGT-3’ (3) 5’-GCAAAGTACTTTTGTGCTCTTG-3’ (4) 5’-GGGTTCCTTTTCCAAGGATGAG-3’ (5) 5’-GAGTTACTTACTTGGTTCCAC-3’ (6) 5’-AAATGCTAGCTATTTCACCCA-3’ (7) 5’-TCATCCATCTCTCTCTCTTC-3’ (8) 5’-GAGTCATGTCAGCCATTGAG-3’ (9) 5’-GCACCATCAGAGAGAGATGA

PCR 扩增免疫球蛋白重链的CDR3基因 在B细胞发育过程中,V―D―J的重排可导致某些核苷酸的随机缺失或插入。因此,不同的B细胞克隆经PCR后产生的扩增片段长短不一。正常的多克隆淋巴细胞群的扩增片段含有不同长度的片段,电泳检查时呈现出所谓的“片状”结构,而单克隆的B淋巴细胞白血病标本经PCR扩增后,产生一明显的同一长度的扩增片段,电泳时呈现出紧密折带状结构。这就是应用PCR快速检测单克隆性的残留白血病细胞的原理。白血病细胞标本经扩增后产生110bp上下的带,而正常的多克隆细胞则呈现为片状结构。 免疫球蛋白基因的重排具有多样性,表现为PCR扩增后产物在电泳位置上的改变,同一白血病细胞克隆的扩增产物在电泳的位置上相同。因此,可以单一的应用PCR扩增,经6％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,溴化乙锭染色后进行观察,对残留白血病细胞克隆进行检测,也可以达到相当高的检测敏感性(1/104 ),如应用放射性同位素标记的寡核苷酸探针杂交分析,可以达到更高的敏感性。 利用引物5’末端提供的限制性内切酶位点,可以将扩增产物进行序列分析。

免疫细胞的分离 免疫细胞是泛指所有参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞及其前身，包括造血干细胞、淋巴细胞、单核巨噬细胞及其它抗原提呈细胞、粒细胞、红细胞、肥大细胞等。 各种免疫细胞的分离、纯化及其功能测定对于了解其在免疫应答中的作用及相互关系有着重要意义。免疫细胞的检测即是用体外试验对机体各种参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞进行分离、纯化鉴定、计数和功能测定,籍以了解机体的免疫状态,并对某些临床疾病的诊断、疗效观察及预后判断等也有一定意义。 免疫细胞的分离的原理和手段 免疫细胞包括多种细胞成分，例如淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、红细胞等。它们具有不同的形态和功能特性，这不仅是我们认识各种免疫细胞的依据，也是分离各种免疫细胞的基础。细胞的形态特征反映在其物理性状上，如各种细胞的大小、比重、表面电荷和粘附能力等存在差异；而细胞的功能特征往往由该细胞膜表达的蛋白质（表面标记）来体现，例如各种免疫细胞执行特定功能必须表达的受体等。根据不同形态和功能特征，可以将各种免疫细胞从混合细胞群体中分离出来。免疫细胞分离原理基本上可以归

抗体/补体介导的特异性细胞毒作用分离法分离T细胞亚群 人T淋巴细胞按其表面标志分为CD4+ T和CD8+ T细胞两类，其细胞膜上分别有CD4和CD8分子，当它们与相应的鼠抗人单克隆抗体结合后，在补体的参与下，可溶解相应的T细胞亚群，从而分离出另一种细胞亚群。 【试剂及配制】 （1） 聚蔗糖-泛影葡胺分层液（D=1.077±0.001）。 （2） Hank’s液（内含5%小牛血清和1.0g/L叠氮钠）。 （3） 兔新鲜血清，肝素 （4） 抗CD4和抗CD8单克隆抗体。 【操作方法】 （1） 取肝素抗凝外周血，用聚蔗糖-泛影葡胺分层液分离单个核细胞(PBMC),配成1´107 /ml细胞悬液； （2） 取1 ml细胞悬液与适量的抗CD4单克隆抗体反应，37℃孵育30min； （3） 用Hank’s液洗2次，1000r/min,10min,去除游离抗体； （4） 加入新鲜的适量的兔血清反应，37℃ 1h； （5） 离心1000r/min，10m

聚苯乙烯表面可以用作亲和性试剂的不溶性基质，以分离淋巴细胞亚群。聚苯乙烯培养皿首先用纯化的羊抗鼠IgG抗体包被，然后将鼠抗人(如抗CD4或抗CD8单抗)与T细胞反应的细胞悬液加入培养皿中，孵育一段时间后，对CD4或CD8抗原特异的T细胞即结合到平皿表面，而CD8+或CD4+细胞不结合，轻吸出未贴壁的细胞悬液，洗下粘附细胞。 [试剂及配制] (1)聚蔗糖-泛影葡胺分层液(D=1.077±0.001) (2)抗CD4和抗CD8单克隆抗体 (3)羊抗鼠IgG 抗体 (4)Hank’s液(含5%小牛血清、不含Ca2+、Mg2+) (5)pH 9.0, 0.05mol/L Tris-HCl缓冲液 (6)pH 7.5, 0.15mol/L PBS(含10%小牛血清) (7)pH 7.2, 0.15mol/L PBS (8)盐酸利多卡因(20mg/ml) [操作方法] (1)羊抗鼠IgG抗体包被聚苯乙烯平皿

红细胞花环法检测各类免疫细胞的数量 【基本原理】 采用戊二醛交联技术将McAb或兔抗鼠IgG与羊红细胞（SRBC）结合，制成致敏的SRBC。抗体致敏的SRBC可与T淋巴细胞直接或间接结合，在T淋巴细胞周围形成花环。通过计数花环形成率，从而确定T淋巴细胞各亚群。该方法可分为直接红细胞花环法和间接红细胞花环法。现以间接花环法为例。 【试剂及材料】 （1） 醛化二抗致敏的SRBC （2） May-Gruenwald和Giemsa染液。 【操作方法】 （1） 根据待测样品数，取一定量的致敏红细胞悬液，离心去上清，用含20％新生小牛血清（NCS）的RPMI-1640液悬浮，恢复至原体积，4 ℃备用； （2） 用含20％NCS的RPMI-1640液将PBMC配成5×104 /ml。将试管呈20度角斜放，于37 ℃温育45min，吸出非粘附细胞置另一试管中备用。原试管弃去，以免混入粘附细胞； （3） 将上述淋巴细胞悬液分别加入塑料软板中，每孔25μl，

T、B淋巴细胞功能测定 淋巴细胞功能测定可分为体内试验和体外试验。体内主要是进行迟发型超敏反应，借此间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的反应；体外试验方法包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原的增殖试验、细胞毒试验以及其分泌产物功能的测定（淋巴因子的测定见第八章）。淋巴细胞功能测定不仅能够了解机体免疫功能状态，而且是免疫缺陷病诊断的主要依据，也有助于探讨某些疾病的发病机理、疗效判断、推断转归。一、T、B淋巴细胞增殖反应 测定淋巴细胞体外增殖反应是检测细胞免疫功能的常用方法。刺激淋巴细胞增殖的物质可分为二大类：①非特异性刺激物：如植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA）、刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA）、美洲商陆（pokeweed mitogen，PWM）、佛波酯（PMA）等有丝分裂原；能产生A蛋白的葡萄球菌（SAC）、EB病毒、链球菌溶血毒素S、细菌脂多糖（LPS）等微生物及其代谢产物；胃蛋白酶、胰蛋白酶等蛋白物质；抗CD3、CD2、IgM等细胞表面标志的抗体以及某些淋巴因子等；②特异性刺激物：主要是特异性抗原物质，包括各种可溶性抗原和细胞表面抗原

蛋 白 酶 分 类 作 用 位 点 已知抑制物 氨基肽酶 金属蛋白酶 带有自由氨基的L-氨基酸氨基末端；不能分解由X-Pro、-D或-Q组成的肽键 2，2-双吡啶，1，10-菲咯啉 菠箩蛋白酶 巯基蛋白酶 无特异性 a2 巨球蛋白，TPCK, TLCK, 烷化剂 羧肽酶A 锌金属蛋白酶 带有自由氨基酸的L-氨基酸羧基端；不能分解R、P或羟脯氨酸 EDTA, EGTA

LAK细胞和TIL活性的测定基本同NK活性测定方法。但所用靶细胞为对NK不敏感的肿瘤细胞，如Raji、Daudi或自体肿瘤细胞。常采用同位素法如51 Cr释放试验、发光免疫测定法及MTT比色法等。 在此介绍MTT比色法。 试剂及材料 1. 试剂：①四甲基偶氮盐（MTT）；②酸化异丙醇：含0.04mol/L HCl的异丙醇；③96孔细胞培养板。 2. 肿瘤细胞系： Raji细胞、Daudi细胞为B细胞性白血病细胞株；Molt-4为T细胞性白血病细胞，对LAK细胞敏感，而对NK细胞毒作用不敏感；K562为红白血病细胞株，对NK细胞毒作用敏感。所有细胞株均培养在含10%～20%NCS的RPMI-1640完全培养液中，取对数生长期细胞经不完全工作培养液洗涤，台盼蓝染色计数，以含20%NCS的RPMI-1640培养液调整细胞浓度至2×106 /ml备用。 操作方法 1. 按上述方法分离LAK细胞或TIL，用含IL-2的20%NCS-RPMI-1640调整LAK细胞或TIL浓度至1.5x106 /ml； 2. LAK细胞或TIL与不同的白血病细胞株按效靶为1:1～20的

乳酸脱氢酶释放试验测定NK细胞活性 【基本原理】 乳酸脱氢酶（LDH）是活细胞胞浆内含酶之一，在正常情况下，不能透过细胞膜。当靶细胞受到效应细胞的攻击而损伤时，细胞膜通透性改变，LDH可释放至介质中.释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶I（NAD+ ）变成还原型辅酶I（NADH2 ），后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）还原碘硝基氯化氮唑蓝（INT）或硝基氯化四氮唑蓝（NBT）形成有色的甲 类化合物，在490nm或570nm波长处有一高吸收峰，利用读取的OD值，经过计算即可得知NK细胞活性。 【试剂及材料】 （1） LDH底物溶液（临用前配制）:硝基氯化四氮唑蓝（NBT）4mg，氧化型辅酶I 10mg，吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）1mg，加蒸馏水2ml溶解，混匀后取上液1.6ml加1 mol/L乳酸钠0.4ml，然后加入0.1mol/L pH 7.4 PB至10ml。 （2） 1％NP-40:用RPMI-1640培养液配制。 （3） 1 mol/L柠檬酸终止

H33342 释放法检测单核-巨噬细胞胞毒作用 【基本原理】 H33342（Hoechst33342）为DNA的特异性荧光染料，可用其标记肿瘤细胞以检测单核细胞对肿瘤细胞的杀伤效应。被损伤的靶细胞DNA断裂后，H33342释放到上清液中，采用微量荧光仪可定量测定上清液中的荧光强度。效应细胞的杀伤活性与靶细胞释放的荧光强度呈正相关。该方法同样可用于CTL、NK、LAK或TIL等杀伤细胞的活性检测。 【试剂及材料】 （1） 靶细胞（L929细胞株，对单核细胞的杀伤活性敏感） （2） H33342 （3） 微量荧光"W"测量板（德国Dynatech公司产品） （4） 用自动微量荧光分析仪（Micro-FluoDynatech） 【操作方法】 （1） 从单个核细胞中采用粘附法分离的单核细胞，经非特异性酯酶（ANAE）和台盼蓝染色，细胞纯度应>90％，细胞活力应>95％； （2） 收获靶细胞并将细胞浓度调至1×

单核-巨噬细胞趋化功能的检测 【试剂及材料】 （1） 趋化因子（见附注） （2） Hanks液（pH7.2） （3） 特制的上、下两层多孔趋化小室 （4） Giemsa或瑞氏染液 【操作方法 】 （1） 分离单核细胞，用Hanks液（pH7.2）调整为2～3×105 细胞/ml； （2） 将趋化因子液25μl加入趋化小室的下室。将滤膜光泽的一面朝向趋化因子盖在孔上，并将滤膜左上方剪去一小角； （3） 盖上趋化小室的上室部分，用固定器夹紧； （4） 将单核细胞悬液50μl注入上室。操作时不能产生气泡，因气泡妨碍细胞的移动； （5） 各孔注入单核细胞悬液后，盖以25mm×80mm的载玻片，覆盖全部孔。在37℃，5％CO2 温箱中静置90min诱导细胞趋化移动； （6） 从温箱中取出多孔趋化小室；松开固定器，将小室上、下倒置放在预先准备好的纸垫上，取下滤膜； （7）

嗜碱性粒细胞功能的测定―嗜碱性粒细胞脱颗粒试验 嗜碱性粒细胞不仅参与速发型超敏反应，而且参与机体抗肿瘤免疫应答。检测嗜碱性粒细胞的功能有助于过敏性疾病的诊断和肿瘤的预后判断。 【试剂及材料】 （1） 新鲜的抗凝血（用0.1mol/L pH7.7 EDTA抗凝血） （2） Hanks液 （3） Alcian蓝染液 【操作方法】 （1） 分离的嗜碱性粒细胞，用Hanks液洗2次，每次1500r/min离心10mi； （2） 吸去上清液，留约0.3ml沉淀，轻轻振摇使细胞重悬； （3） 取过敏原50μl，与细胞悬液50μl混合，放置37℃水浴30min，以同量缓冲液代替过敏原作为对照管； （4） 加Alcian蓝染液150μl，混匀，置15～25℃过夜。次日计数9大方格内染成蓝色的嗜碱性粒细胞数（F）； 【结果分析】 计算脱颗粒指数（DI）

红细胞C3b受体花环及免疫复合物花环试验 近年来的研究表明红细胞也是一类免疫细胞。红细胞免疫功能主要是藉助其膜表面分子（如CR1、CR3、CD58、CD59、DAF、SOD酶等）的免疫粘附作用，在体内起清除垃圾的"清道夫"作用。 【基本原理 】 红细胞膜上C3b受体可与补体致敏的酵母菌粘附形成花环（RBC-C3bR花结）；红细胞膜上粘附的IC中C3b分子可与未致敏的酵母菌粘附形成花环（RBC-IC花环）。 【试剂及材料】 （1） 待测红细胞悬液：将肝素抗凝的指血或静脉血用生理盐水洗涤离心3次，2000r/min离心3～5min，计数后配成1.25×107 /ml 红细胞悬液备用； （2） 补体致敏的酵母菌试剂:将酵母菌用生理盐水洗涤3次后，配成1％悬液，置水浴内煮沸20min，充分混匀。用二层定性滤纸（或16层纱布）过滤，除去小凝块，在低倍镜下呈单个酵母菌细胞分散状态。加等量小白鼠血清，混匀后置37℃水浴致敏15min。用生理盐水洗涤一次，25

红细胞的SPA-酵母菌混合花环试验 【基本原理】 葡萄球菌A蛋白（SPA）能与红细胞膜上粘附的IC中IgGFc段相结合，而补体致敏的酵母菌能与红细胞膜上未粘附IC的C3b受体相结合，各自形成花环。 【试剂及材料】 （1） 金黄色葡萄球菌：一般选用金黄色葡萄球菌的国际标准株CowanⅠ（ATCC 12598或NCTC8530），用不含SPA的Wood 46株作为阴性对照。目前已有冻干的SPA菌体制剂出售。 （2） 补体致敏的酵母菌试剂：制备方法同上。 【操作方法】 （1） 在试管内加入洗过3次的待测红细胞悬液50ｕl和补体致敏酵母菌悬液50ｕl，混合，放37℃水浴30min； （2） 加50ｕlSPA菌体悬液（6.25×108 ml）混匀，37℃水浴30min； （3） 取出水平涂片、瑞氏染色、油镜观察。 【结果分析】 涂片染色后RBC为红色，酵母菌为蓝色，SPA菌体为浅蓝色。RBC上粘附2个以上酵母