抗体库技术 抗体库技术的主导思想是将某种动物的所有抗体可变区基因克隆在质粒或噬菌体中表达，利用不同的抗原筛选出携带特异抗体基因的克隆，从而获得相应的特异性抗体。 从抗体库中筛选多种重要的抗体，如膜蛋白抗原、自身抗原、病毒抗原的抗体。这些显示出抗体库技术的应用潜力。 抗体库技术不仅可以模拟动物免疫系统产生抗体的过程，还具有许多独特的优点，令杂交瘤技术难以相比。抗体库技术无需免疫，从理论上讲，106 ～108 的库容就可能包容所有的抗体。利用抗原即可直接从非免疫动物抗体库中筛选出特异性抗体，并能筛选到针对该物种自身抗原的抗体。从人的抗体库中可以得到完全是人源的McAb，克服了难以用杂交瘤技术获得人源McAb的障碍。此外，由于细菌细胞增殖快，培养成本低廉，利于大量制备高纯度抗体，进行蛋白晶体结构研究和应用。因此，抗体库技术将对生物学和医学的发展起着重要的推动作用。 抗体库技术包括下述主要过程：克隆出抗体全套可变区基因，与有关载体连接，导入受体菌系统，利用受体菌蛋白合成分泌等条件，将这些基因表达在细菌、噬

基因工程抗体的表达 基因工程抗体的表达主要问题是选择适当的宿主和表达载体的设计，这是获得高亲和力抗体的重要前提。目前，广泛用于研究抗体表达的宿主系统是大肠杆菌和哺乳动物细胞，最近在植物中表达抗体成为抗体研究的热点。表达抗体的纯化手段当前发展为金属螯合层析(IMAC)，其特点为快速简便，效率及纯度都很高。抗体的活性测定除采用常规方法外，可用间接方法如免疫竞争抑制等，可测定因缺少恒定区的小分子抗体如ScFv、VH的抗原结合活性。另外，由于高纯度的抗原难以大量获得，也给抗体的鉴定带来许多困难。抗体的表达首先要选择适合的表达载体或重新构建载体；其次，依赖于不同的宿主系统对抗体基因进行表达及表达产物的加工和修饰，使其具有抗原结合活性。目前，多种宿主系统中表达抗体均取得成功。 1．哺乳动物细胞的表达 哺乳动物细胞具有高效表达内源性重、轻链基因并将抗体糖基化、正确折叠和装配以及分泌活性抗体的能力，便于对抗体亲和力、特异性等的鉴定。通常使用的表达载体，有一个真核转录单位，一个启动子，剪接信号和PolyA添加信号及筛选标志，所用的表达元件来自病毒或抗体基因自身，如启动子、增强子。由于抗体表达的组织

基因工程抗体细胞质表达 胞内表达抗体主要采用高表达方式，其表达结果因抗体片段的不同而有较大差异，主要取决于翻译起始位点的设计、片段对蛋白酶的敏感性和宿主菌。高表达抗体的结果常常是以包涵体(inclusion body)形式存在，除载体方面的原因外，这可能与抗体表面疏水性强有关。包涵体可以防止宿主对抗体的降解，并利于纯化。经过变性、复性及去除蛋白的N端甲酰甲硫氨酸或甲硫氨酸，可以得到重新折叠的有抗原结合活性的天然分子。对于不同的蛋白，复性条件是不同的。 【材料和试剂】 （1）大肠杆菌XL1-Blue。 （2）载体pROH80，携带谷胱甘肽转移酶基因(GST)，能与插入的抗体基因表达出融合蛋白(GST-ScFv)。 （3）抗膀胱癌McAb重链(VH)366bp和轻链(VL)324bp基因，连接肽为(GGGGS)3。 （4）超声仪（Cole Parmer4710)。 （5）IPTG。 (6) 包涵体溶解液：0.2mol/L Tris-HCl pH8.2、0.1mmol/L β-巯基乙醇。

基因工程抗体分泌型表达 在表达载体上装入信号肽序列，可以使抗体片段分泌到细胞外或周质腔。在表达时抗体完成切断信号肽，蛋白质折叠，二硫键形成，重、轻链的正确装配等一系列过程，能形成有活性的抗体分子。信号肽可利用已知的PelB以及碱性磷酸酶(PhoA)；外膜蛋白A(OmpA)；A-溶血素蛋白(HlyA)等，将抗体基因两条链分别融合到一种或两种信号肽后面，或者同时融合到同一种信号肽后面。融合点被断裂后必需能产生正确的Ｎ端。分泌到周质腔的抗体能正确地折叠和二硫键的形成，另外由于周质腔的蛋白酶较少，减少了对抗体的降解。为提高表达量可以选择蛋白酶缺陷宿主菌(LonHrpi)，降低诱导温度，调整培养基状态等条件。 【材料和试剂】 (1) 载体pWAI80。 (2) 抗体VH、VL基因。 (3) 大肠杆菌JM83。 (4) IPTG。 (5) SB培养基。 【操作步骤】 (1)将VH、VL基因插入载体pWAI80，构建成ScFv抗体，此载体称pFS80。 (2)

基因工程抗体抗体的纯化 对于表达的抗体需要纯化才能准确地进行活性、亲和力的鉴定及应用于临床研究。基因工程抗体的纯化方法与通常抗体纯化方法基本相同。本文主要介绍利用IMAC方法纯化。IMAC的方法原理是利用组氨酸的咪唑基能与二价金属离子，如Cu2+、Zn2+、Ni2+等发生螯合作用，在表达载体的抗体基因插入位点后面设计5～6个组氨酸，这并不影响抗体正确折叠成活性分子，经过一步洗脱，得到纯度较高的抗体。 【材料和试剂】 （1） Ni-NTA Resin(QIAGEN)。 （2） 大肠杆菌XL1-Blue。 （3） 载体pFUW80 （4） 超声缓冲液：50mmol/L磷酸钠缓冲液pH8.0，含300mmol/L NaCl。 （5） 洗脱缓冲液：50mmol/L磷酸钠缓冲液pH6.0，含300mmol/L NaCl。 【操作步骤】 纯化可溶性胞质表达抗体(ScFv) （1)将pFS80转化大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞，筛选阳性克隆，接种单菌落于40ml SB培养基(含Amp 10

多种因素影响免疫亲和层析纯化效果，其中最关键的三个因素是：抗原的初始纯度，抗原与抗体的亲和力，以及抗原抗体结合是否容易发生解离。一、抗原的初始纯度在免疫亲和层析技术中，抗原的初始相对浓度（即纯度）是决定最终产物纯度极为重要的因素，因为抗原-抗体的反应具有相当高的特异性，还没有任何其他一种层析技术能经过一步纯化得到如此高的纯度。然而，纯化的程度不是无限的，免疫亲和层析的纯化效果不低于1000倍，一般可达10000倍。如果所纯化的蛋白质抗原的量非常低，免疫亲和层析必须与其他方法结合，才能获得纯化产物，可以在免疫亲和层析之前或其后采用其他的纯化步骤来完成。例如，常用的方法是在进行免疫亲和层析之前先将样品通过一种或多种标准层析柱；或者将免疫亲和层析的纯化产物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，再转印到尼龙膜上进行微量测序。 二、抗原与抗体的亲和力抗体对相应抗原的亲和力是免疫亲和层析法遇到的最麻烦的问题，抗体的亲和力将决定从含抗原的溶液中捕获抗原的总量，高亲和力的抗体(>108 /mol)能在lh以内完成有效地结合；而低亲和力的抗体(106 /mol)即使在高浓度时也不能结合溶液中的全部抗原。

免疫亲和层析使用的抗体的选择 通过实验比较和经验积累才能发现最适合用于免疫亲和层析的抗体（见表2-1）。这意味着没有轻而易举的捷径能选择到最佳的抗体，最好的方法就是进行预实验，来初步测试这些抗体的效果。可用不同的共价交联微珠进行免疫沉淀试验，然后通过免疫印迹法测定结合的抗原量；另一种方法是将抗原溶液通过小型层析柱，然后用免疫印迹的样品缓冲液进行洗脱。一旦确定与抗原结合性能良好的抗体后，下一步就应用不同的洗脱条件进行试验，以找到一种洗脱峰形较好的抗体。 如果通过预实验发现使用的抗体不适合免疫亲和层析，较好的解决方法是用一个已知特性的表位分子作为标记蛋白，用其他的抗体来捕获此抗原表位。先构建一个包括有该表位分子和目的分子的融合蛋白表达载体，然后表达融合蛋白，后者可以用针对表位的特异性抗体进行分离。 免疫亲和层析的抗体的选择 多克隆抗体 单克隆抗体 信号强度(抗体结

常用交联剂 交联剂 化学名 同源或异源双功能 反应基团 蛋白结合基团 光激活性 间隔臂长(A) DMA 二甲基二亚胺酯 同源 亚胺酯 -NH2 N 8.6 DMP 二甲基亚胺酯 同源 亚胺酯 -NH2 N

常用的活性微珠，活化微珠的交联 交联机制 蛋白质上的结合基团 最终交联的稳定性 推荐基质 商品举例 羰基二咪唑 -NH2 避免pH>10 琼脂糖珠 交联琼脂糖珠 聚丙烯酰胺 CM Bio-Gel A Gel(Bio-Rad) EC

活化微珠交联的常见问题与解决方法 虽然将抗体有效地与活性微珠交联是一项简单的工作，主要问题是要保持抗体的活性。抗体失活大多是由于抗体与微珠过度交联，或交联发生在抗体的抗原结合片段，使与微珠交联的抗体结合抗原的能力显著低于未交联的抗体。通常能够保持l0~50％抗体活性，这可认为是活性良好水平。在交联过程中，如果抗体的活性远远低于这一水平，可采取下列三种措施保持抗体活性。 （1） 在彻底交联之前终止反应，交联率可以在开始实验前测定。当不到50％的抗体发生交联时即停止反应，未交联的抗体不会受到影响，并可以用于其他实验，及早终止反应可以控制抗体多位点交联。终止交联反应的恰当时间可通过用少量样本的预实验来确定。未交联的抗体可通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，用考马斯亮兰染色来测定重链和轻链条带。 （2） 调整反应的pH值以减慢交联速度。大多数交联方法是通过抗体上的氨基连接，而氨基基团的反应对pH较敏感。如果抗体交联的pH值低于氨基基团的pK值，大多数氨基基团将不会发生交联，这样就控制了过度交联。采用中性的pH值，有助于这一问题的解

抗原与抗体-微珠基质的结合 虽然使抗原有效地结合到免疫亲和柱上的方法很多，因为抗体是通过共价键交联在微珠上，而不是游离于溶液中，所以交联在微珠上的抗体与抗原结合所需的时间比抗体和抗原二者以游离状态在溶液中所需的时间要长得多，因此，选用的方法应使抗原与交联的抗体达到最大程度的结合。推荐使用两种结合方法：将抗原溶液加入呈糊状的抗体-微珠内，不断混和均匀；或将抗原溶液流经抗体-微珠层析柱，保持抗原与抗体尽可能长时间的接触。一般情况下，应首先选择在抗体-微珠层析柱内结合。若是结果不够理想，可以试用在溶液中结合。先用几支小型层析柱测试最佳结合和收集抗原的条件。 将抗原结合到抗体-微珠基质上之前，应注意抗体的亲和力与抗体-微珠基质结合抗原的容量或能力。 （1）亲和力 虽然抗体对抗原的精确亲和力可以计算，但对一般说来，实用的标准是抗体是否可以将抗原从溶液中分离出来。最简单的方法是建立一个小规模的预实验，测试待纯化的溶液液中抗原的含量。如果抗体-微珠基质在l~2h内不能分离出大部分抗原，可以在实验设计时作一些变动。例如使微珠上交联更

为了将抗原结合到抗体微珠基质上，最简单方法是将微珠装到一个层析柱内，再将抗原溶液流经层析柱，当抗原流经层析柱时结合到抗体上而被固定，直到洗脱时才洗脱下来。这种方法的效率取决于抗原与固定的抗体之间的接触时间，通过控制流速，可以改变抗原抗体之间的作用时间。 准备工作 开始前，要考虑层析柱的类型和尺寸。一般来说，粗而矮的柱子比细而高的柱子容易获得陡峭的洗脱峰，而且也容易将微珠转移到另一个容器中储存。粗矮层析柱的缺点是当改变洗脱缓冲液时易扰动微珠基质。 溶液和设备 1. PBS 2. 简单的层析装置 操作步骤 1. 将抗体微珠转移到一个合适的层析柱中，用20倍柱床体积的PBS洗脱。 2. 将抗原溶液加到层析柱中，让溶液缓慢地（约1ml/h每毫升柱床体积），可以用蠕动泵控制流速。 3. 用20倍柱床体积的结合缓冲液（即PBS）洗涤层析柱。 此层析柱可用于进一步洗涤或洗脱。 常见问题与解决方法 这种方法最大问题就是某些蛋白可能非特异地结合到层析柱上，这些蛋白在洗脱时可以出现在洗脱液中，从而使纯化效果降低。基质本身和抗体基质复合物具有与待检抗原溶液

这是一种使抗体-微珠基质快速捕获抗原的方法，将抗原溶液与微珠混合，搅拌或振荡制成匀浆。这种方法可使抗原与固相化的抗体最大限度地接触。结合反应完成后，将匀浆装入层析柱内，以便收集结合有抗原的抗体-微珠和洗脱抗原。此法可以很好地控制反应时间，充分的利用了抗体结合容量。这比上面介绍的直接用层析柱捕获抗原方法麻烦一些。主要是因为用匀浆装柱比较困难；另一个问题是在混匀过程中会增加抗原溶液中变性蛋白的量，所以使用这种方法的纯化效果可能要差一些。 准备工作 在开始工作前，要考虑装填微珠的层析柱的类型及大小。既要考虑容易获得陡峭的洗脱峰，又要方便匀浆装柱。 溶液和特殊设备 1. 结合缓冲液（通常为PBS） 2. 摇床和简单的层析设备 操作步骤 1. 将抗体-微珠基质加入抗原溶液内。所加微珠的体积应通过预试验确定，调整微珠的用量，使其在结合反应所需时间内能够结合所有的抗原。微珠的最终浓度大约为lml湿珠加到10~20ml溶液中。 2. 4℃孵育微珠-抗原匀浆，并轻轻混合。常用的方法是在一封闭的容量中振荡或置平板摇床上涡旋混匀。孵育时间根据步骤1的预试验确定，预试验时可

【准备工作】 此步骤最大的难点是确定恰当的洗脱条件。为了获得一个清晰的洗脱峰和较纯的抗原，需要花费大量的时间进行试验和调整洗脱条件。 【溶液和特别设备】 （1）预洗脱缓冲液 （2）洗脱缓冲液 （3）中和缓冲液 （4）简单的层析装置 （5）透析袋及相应的装置 如果是对蛋白层析很有经验者可采用分段增加洗脱条件而不采用逐步洗脱。 【操作步骤】 （1）用20倍柱床体积的预洗脱缓冲液洗柱，以更换柱内的缓冲液。 （2）采用分段洗脱，连续以 0.5倍柱床体积的洗脱缓冲液流经层析柱，用试管收集各组分，如果洗脱液pH偏高或偏低，收集管中需加入0.1柱床体积的中和缓冲液。 （3）测试每管抗原量，将含量高的各管合并，根据抗原的用途，可将获得的蛋白洗脱液透析去盐或用缓冲液调节pH值。 （4）再用20倍柱床体积的起始缓冲液通过柱基质，使层析柱再生。加入0.01％硫柳汞，可以长期贮存(4 ℃)。 【测试洗脱条件的策略】 建立最佳洗脱条件需要积累经验，将可能利用的洗脱缓冲液先在小型柱上进行预试，以

快速裂解酵母细胞制备样本（蛋白质的电泳分离） 使用这种方法会使蛋白质变性，在所用抗体能识别变性靶蛋白时才能使用这一方法。 【试剂与设备】 （1）待检测的酵母菌 （2）25%三氯乙酸（TCA） （3）1%SDS （4）丙酮 （5）RIPA缓冲液： 50mmol/L Tris•HCl (PH7.5) 150mmol/L NaCl 1% Nonidet P-40 (NP-40) 0.5% 去氧胆酸钠 0.1% SDS （6）玻璃珠（直径0.45～0.50mm） （7）台式离心机 （8）水浴箱 （9）涡漩振荡器 （10）加样器与吸头等 【操作步骤】 （1）0℃以12 000g离心1min，从1ml培养物中收集细胞，废弃上清液（当靶细胞为分泌型蛋白时除外）； （2）用0.5ml 25%三氯乙酸（TCA）重悬细胞； （3）按步骤1离心回收细胞，重悬于1ml 90%丙酮中；

哺乳动物细胞和组织的样本制备（蛋白质的电泳分离） 哺乳动物细胞和组织有单层培养细胞、悬浮培养细胞和组织碎片，虽然均可采用凝胶加样缓冲液裂解的方法来制备样本，但制备方法有所差异。 1、对单层细胞的处理方法 【试剂与设备】 （1）磷酸缓冲盐溶液（PBS） （2）1×SDS凝胶加样缓冲液（参见上述“细菌表达蛋白质和样本制备”） （3）水浴箱 （4）吸管、细胞刮棒等 【操作步骤】 （1） 用磷酸缓冲盐溶液（PBS）漂洗细胞2次，弃去洗液并吸净残余的PBS液体； （2） 如直径为90mm的平皿，则加入100～200ul加热到85℃的1×SDS凝胶加样缓冲液溶解细胞，用细胞刮棒把粘稠状的细胞裂解物收集于一个微量离心管中。 2、对悬浮培养细胞和组织碎片的处理方法 【试剂与设备】 （1）悬浮缓冲液的配制 0.1mol/L NaCl 0.01mol/L Tris�Cl (pH 7.6) 0.001mo

免疫沉淀蛋白的样本制备（蛋白质的电泳分离） 一般情况下，粗提样品无需进一步纯化即可直接进行凝胶电泳。但下述两种情况在免疫印迹之前，使用免疫沉淀制备蛋白的效果较好。一是含量极稀少蛋白的检测，由于适合凝胶电泳分辨的蛋白质总量有一定限度，通常不可能在凝胶中加入足够量的蛋白质样品来检测含量极稀少的抗原，此时可采用标准的免疫沉淀技术纯化和浓缩待测蛋白；二是免疫沉淀可用来确定蛋白质与蛋白质之间的相互作用，此时，用于免疫沉淀的抗体和免疫印迹的抗体分别针对复合物中的不同蛋白质，如果清楚该复合物的性质，并知道应该使用何种抗体时，这种方法就非常有用，为研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用提供了一种有效的方法。 【试剂与设备】 （1）样品缓冲液： Tris/Glycine SDS-PAGE样品缓冲液是：2% SDS，100mmol/L DTT（取自-20°C存放的1mol/L贮存液，临用前加入），60mmol/L Tris（ pH 6.8），0.01% 溴酚蓝和10% 甘油。 （2）水浴锅 （3）加样器和吸头等 【操作步骤】 （1）将样品缓冲液加入吸

转印后切取印迹膜 有时转印后需将印迹剪成较小的片状进行单独处理。单个泳道可以泳动同一样品，待彼此分开后，可用不同的抗体并列检测。如以电泳方向剪膜，就可在同一样品中检测不同分子大小的抗原。为了简便而精确地找到泳道，电泳之后用丽春红S（Ponceaus S）或印度墨汁对印迹膜进行染色，便可很快确定待测蛋白质的位置并将其剪下。表表明两种染料的的适用范围及优缺点，用丽春红S染色的优点是操作简便，价廉和具有可逆性，在封闭过程中，染色易消褪，且不干扰进一步的检测。 在某些情况下，可能想用印迹中的较高分子量区域来检测一种抗原，用另一个区域来检测另一不同分子量的蛋白质。为了使印迹中不同的区域正好对应于相应分子量的范围，这需要在对照泳道中加入已知分子量的蛋白质。这样可方便地在印迹中找到适当的区域并将其剪下。 使用预染的分子量标记，可为转印后切下所需印迹提供良好的指示，此类标记已商品化，但是比丽春红S染色法昂贵。标记中的颜色除了增加成本对实验并无不良影响，而且在泳动时非常漂亮。 用于免疫印迹染色的染料

时间分辨荧光免疫分析（以血清中T3 和T4 检测为例） 时间分辨荧光免疫分析（time resolved luoro-immunoassay，TrFIA）技术出现于20世纪80年代初期，是在免疫荧光分析的基础上发展的一种新型超微量物质免疫分析方法。TrFIA采用镧系稀土元素标记抗体，利用荧光发射体的荧光寿命差别将波长相同的荧光分开，排除样品中的非特异荧光的干扰，从而最大限度地提高分析方法的灵敏度。该方法在灵敏度、特异性、稳定性及测量自动化等方面可与放射免疫分析（RIA）相媲美，最小检出值可达10-8 mol/L，且无放射性污染。 【基本原理】 镧系稀土元素铕（Eu3+ ）、钐（Sm3+ ）等通过具有双功能集团的螯合剂，容易与抗体分子以共轭双键结合制成标记物。当标记抗体和抗原结合后，稀土元素螯合物在紫外光（340nm）激发下，不仅发射出高强度的荧光（613nm），而且衰变时间较长（10ms-1ms），而待测样品中各种蛋白荧光和其他化合物的非特异荧光的衰变时间一般在1ns-10ns，最长不超过20ns。利用延缓测量时间，待样品中的非特异的、短命荧光

改良过碘酸钠标记法制备酶标抗体 HRP分子中与酶活性无关的糖基被过碘酸钠氧化为醛基，再与抗体蛋白的氨基形成Schiff碱。为了防止酶蛋白的氨基与醛基发生自身偶联，在标记前先用2，4-二硝基氟苯(DNFB)封闭酶蛋白中残留的a-和e-氨基。酶与抗体的结合反应后，再加入硼氢化钠还原成稳定的结合物。 (1) 取HRP 5mg溶于0.2mol/L，pH5.6醋酸盐缓冲液1ml中，加入1%DNFB无水乙醇溶液0.1ml，室温下轻微搅拌1h； (2) 加入新鲜配置的0.1mol/L NaIO4 0.5ml，此时溶液由原棕色变为墨绿色，置4℃放置30min，此时溶液由原棕色变为墨绿色； (3) 加入2.5%乙二醇1ml， 室温下轻微搅拌1h，终止反应； (4) 加入待标记的抗体5-10mg， 用1.0mol/L， pH9.5 CBS，调节pH值至9.0； (5) 混匀，置4℃过夜 (6) 加入硼氢化钠溶液0.1ml，混匀，4℃放置3h； (7) 对0.01mol/L，pH7.4 PBS，4℃透析过夜，换液3次； (8) 3000r/