一、目的要求 1. 掌握酯化反应和重结晶的原理及基本操作。 2. 熟悉搅拌机的安装及使用方法。 二、实验原理 阿司匹林为解镇痛药，用于治疗伤风、感冒、头痛、发烧、神经痛、关节痛及风湿病等。近年来，又证明它具有抑制血小板凝聚的作用，其治疗范围又进一步扩大到预防血栓形成，治疗心血管疾患。阿司匹林化学名为2-乙酰氧基苯甲酸，化学结构式为： 阿司匹林为白色针状或板状结晶，mp.135~140℃，易溶乙醇，可溶于氯仿、乙醚，微溶于水。 合成路线如下： 三、实验方法 （一）酯化 在装有搅拌棒及球形冷凝器的100 mL三颈瓶中，依次加入水杨酸10 g，醋酐14 mL，浓硫酸5滴。开动搅拌机，置油浴加热，待浴温升至70℃时，维持在此温度反应30 min。停止搅拌，稍冷，将反应液倾入150 mL冷水中，继续搅拌，至阿司匹林全部析出。抽滤，用少量稀乙醇洗涤，压干，得粗品。 （二）精制 将所得粗品置于附有球形冷凝器的100 mL圆底烧瓶中，加入30 mL乙醇，于

未回收或回收率低 1. 胶块未全部溶解.溶解凝胶时应置于55℃水浴，不断上下颠倒，确定胶块完全溶解后再进行下一步骤。 2. 胶块太大（>400 mg）.如果需要处理的胶块太大，应先将其切成小块，做两次回收或选用大量型回收 试剂 盒。 3. 电泳缓冲液pH值太高.硅胶膜在高盐及低pH值（pH≤7.5）时可结合DNA，在低盐及高pH值（pH≥8）条件下洗脱。如果电泳缓冲液pH值太高，会导致DNA无法结合或降低结合率。可在溶胶后加入 10μl KAc（pH5.0），将pH值调至7.5以下。 4. 漂洗液中未加无水乙醇.第一次使用前应在漂洗液中加入无水乙醇。漂洗液每次用后应拧紧瓶盖，以免乙醇挥发，降低回收率。 5. 洗脱缓冲液不合适.DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB (10 mM Tris·Cl, pH8.5)或水。洗脱效率取决于pH值。最大洗脱效率在pH 7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内。 6. 洗脱缓冲液未加在离心柱中间尤其使用较少

实验目的 通过实验学会感受态细胞的制备方法和DNA转化的最基本操作，以及如何提高转化效率的思路。本实验综合因素较多，难度较大，是分子生物学中的一个很关键的实验手段。 实验原理 转化是指某一细胞系由于接受了外源DNA，而导致其原来的遗传性状发生改变，这种遗传性状包括遗传型和表型的改变。 感受态是受体菌能接受外源DNA能力的一种生理状态。用CaCl2处理细菌，改变细胞膜的结构，使质粒DNA能够穿过细菌细胞膜进入细胞。然后在选择性培养基中培养转化处理过的细菌，转化成功的细菌可以在选择性培养基上生长形成菌落。 本实验采用质粒pUC118转化大肠杆菌DH-5a，通过氨苄青霉素抗性筛选转化子。 图1-1　　质粒pUC118/pUC119图谱 实验材料和试剂 （一）实验材料 大肠杆菌DH-5a 质粒pUC118（ampicillin，AmpR） （二）培养基和试剂 1. LB

逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 一、反转录酶的选择 1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。 2． 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。 3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消

实验目的 1. 掌握将目的基因插入表达载体中表达目的蛋白的技术路线和试验流程。 2. 了解通过诱导重组DNA表达目的基因的技术。 实验原理 P L P R 启动子是大肠杆菌l噬菌体中控制早期转录的启动子，具有极强的起始RNA转录的功能，基因工程中常用它来构建高效表达载体，它受抑制物CI蛋白的负调控。在实际中CI蛋白被改造成温度敏感型(CIts)，由DNA片段CIts857（857bp长）编码。CIts在30℃时具有抑制启动子的活性，在42℃时失活而失去抑制启动子的活性，因此，改变工程菌的培养温度即可控制目的基因的表达，这一点比用诱导剂诱导表达的系统要节省操作步骤和成本，在大规模基因表达中优点尤其明显。有些表达载体本身带有CIts857片段，能自身编码CIts蛋白，对宿主的选择范围较宽；另一些表达载体自身不带CIts857片段，选择宿主茵时，要求宿主是有缺陷的原噬菌体溶源化的菌株（如M5219)，前一类载体表达效率往往更高。 将IL基因以5’端 Eco

【 实验目的 】 1．通过实验掌握水平方向滤纸层析原理和技术 2．了解转氨作用过程。 【 实验原理 】 转氨基作用是由转氨酶（氨基转移酶）催化的，在这个反应中，α-氨基酸的氨基与α-酮酸的酮基之间交换，α-氨基酸转变成相应的α-酮酸，α-酮酸变成新的一种α-氨基酸。转氨基作用是一种可逆反应。每个转氨基反应均由专一的转氨酶所催化，在不同的生物有机体中均有转氨酶分布。 本实验是将丙氨酸和α-酮戊二酸与肝匀浆一起水浴反应，肝中的丙氨酸氨基转移酶（ALT，又称谷丙转氨酶GPT）含量丰富，该酶可将丙氨酸的氨基转移给α-酮戊二酸，产生丙酮酸和谷氨酸。利用圆盘纸层析鉴定谷氨酸的存在，并且验证组织中的转氨作用。在肝脏谷丙转氨酶(GPT)催化的转氨基作用，反应方程式如下： 【 实验材料 】 1． 实验器材 培养皿；表面皿；滤纸；匀浆器；试管；试管架；恒温水浴锅；毛细管；移液管；喷雾器；剪刀；铅笔；格尺。 2． 实验 试剂 ⑴ 0.01M pH7.

（一） 试剂 1. 30%丙烯酰胺 丙烯酰胺 29 g N，N’-亚甲双丙烯酰胺 1 g 蒸馏 水 100 ml 加热至50℃搅拌溶解，于4℃保存。 2．10%SDS： 蒸馏 水配制，室温保存。 3．10%过硫酸铵：蒸馏水配制，4℃保存，一周内使用。 4．TEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二胺） 5．1.5mol/L Tris-HCl（pH8.8）和1.0mol/L Tris-HCl（pH6.8） 6．电泳缓冲液 25 mmol/L Tris-HCl（pH8.0） 250 mmol/L 甘氨酸 0.1% SDS 7．电泳加样缓冲液 50 mmol/L Tris-HCl（pH6.8） 50 mmol/L 二硫苏糖醇（ DTT ） 2 % SDS 1 % 溴酚蓝 1

一、目的： 学习索氏提取法测定粗脂肪含量的原理及方法。 二、原理： 所谓粗脂肪，是脂肪、游离脂肪酸、蜡、磷脂、固醇及色素等脂溶性物质的总称。 索氏（soxhlet）脂肪提取器为一回馏装置（图2-1），由浸提管、小烧瓶及冷凝管三者连接而成。浸提管两侧分别有虹吸管及通气管，盛有样品的滤纸斗（包）放在浸提管内。溶剂（乙醚）盛于小烧瓶中，加热后，溶剂蒸汽经通气管至冷凝管，冷凝之溶剂滴入浸提管，浸提样品。浸提管内溶剂愈积愈多，当液面达到一定高度，溶剂及溶于溶剂中的粗脂肪即经虹吸管流入小烧瓶。流入小烧瓶的溶剂由于受热而气化，气体至冷凝管又冷凝而滴入浸提管内，如此反复提取回馏，即将样品中的粗脂肪提尽并带到小烧瓶中。最后，将小烧瓶中的溶剂蒸去，烘干，小烧瓶增加之重量，即样品中粗脂肪含量。 三、器材及 试剂 ： 1．器材： ①麦麸以及其他动、植物材料。 ②滤纸。 ③索氏提取器（一套）。 ④分析天平。 ⑤恒温水浴锅

【实验原理】 多糖在浓硫酸中保温一定时间可完全水解为单糖，通过纸层析分离，特定 试剂 显色后与已知糖的标准混合物作对比，可以鉴定多糖水解产物中单糖的组成。 【实验材料】 1. 实验器材 水解管；滤纸；玻璃毛细管；层析缸；喷雾器。 2. 实验 试剂 ⑴ 标准糖溶液: 称取一定量的半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖，用 蒸馏 水溶解，得标准糖混合溶液(每种糖的点样量为20微克~30微克)。 ⑵ 展层剂： 正丁醇：乙酸：水=4：l：5 (上层)。 ⑶ 显色剂：苯胺-邻苯二甲酸-正丁醇饱和水溶液(邻苯二甲酸1.6g溶于水饱和的正丁醇100 ml，加苯胺0.93g（相当于0.9 ml）。 ⑷ BaCO3；1mol/L硫酸。 【实验操作】 l．完全酸水解： 称取20 mg多糖样品，加入1mol/L H 2 SO 4 2ml；封管，l00℃水解8小时，然后加入BaCO 3 中和，定量 滤纸 过滤，滤液

实验目的： 1.掌握分光光度计的使用方法。 2.掌握标准管法测物质含量的方法。 3.掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法。 一、原理： 双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物，在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色络合物，此反应即为双缩脲反应。含有两个或两个以上肽键的化合物都具有双缩脲反应。 蛋白质含有多个肽键，在碱性溶液中能与Cu 2+ 络合成紫红色化合物。其颜色深浅与蛋白质的浓度 成正比，可以用比色法进行测定。双缩脲法最常用于需要快速但并不需要十分精确的测定。 二、 试剂 和器材 试剂 : (1) 标准蛋白溶液（5mg/ml）:准确称取已定氮的酪蛋白(干酪素或牛血清白蛋白)用0．05mol/L氢氧化钠溶液配制，冰箱存放备用。 (2) 双缩脲试剂:溶解1.5g硫酸铜（CuSO 4 ·5H 2 O）和6.0g酒石酸钾钠（NaKC 4 H

【 实验目的 】 1.学习Folin-酚 试剂 法测定蛋白质含量的原理。 2.掌握Folin-酚 试剂 法测定蛋白质含量的方法和操作。 【 实验原理 】 蛋白质中含有酪氨酸和色氨酸残基，能与Folin-酚试剂起氧化还原反应。反应过程分为两步，第一步：在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的Cu 2+ 作用生成蛋白质-Cu 2+ 复合物；第二步：蛋白质-Cu 2+ 复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。该呈色反应在30分钟内即接近极限，并且在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故可用比色的方法确定蛋白质的含量。进行测定时要根据蛋白质浓度的不同选用不同的测定波长：若蛋白质含量高时（25-100μg）在500nm波长处进行测定，含量低时(5-25μg)在755nm波长处进行测定。最后根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白质的含量。 Folin-酚试剂法操作简便，灵敏度高，样品中蛋白质含量高

[目的] 掌握Lowry法测定蛋白质浓度的原理。 [原理] 蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu 2+ 螯合，形成蛋白质一铜复合物，此复合物使酚 试剂 的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，在一定条件下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度。 [操作] 取试管7支、编号、按下表操作： 立即混匀，在20℃～25℃水浴保温30分钟。用660nm比色，测定光密度值。 操作注意事项： 1． 按顺序添加 试剂 2． 试剂乙在酸性条件下稳定，碱性条件下（试剂甲）易被破坏，因此加试剂乙后要立即混匀，加一管混匀一管，使试剂乙（磷目酸）在破坏前即被还原。 [计算] (一)绘制标准曲线。以浓度为横坐标，光密度值为纵坐标绘制标准曲线。 (二)以测定管光密度值，查找标准曲线，求出待测血清中蛋白质浓度(g／L)。 (三)再从标准管中选择—管与测定管光密度相接近者，求出待测血清中蛋

[目的]: 掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理，熟悉紫外分光光度计的使用。 [原理] : 蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸。它们具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在280nm波长处，且在此波长内吸收峰的光密度值与其浓度成正比关系，故可作为蛋白质定量测定的依据，但由于各种蛋白质的酪氨酸和色氨酸的含量不同，故要准确定量，必需要有待测蛋白质的纯品作为标准来比较，或且已经知道其消光系数作为参考。另外，不少杂质在280nm波长下也有—定吸收能力，可能发生干扰。其中尤以核酸(嘌呤和嘧啶碱)的影响更为严重。然而核酸的最大吸收峰是在260nm。因此溶液中同时存在核酸时，必须同时测定OD 260 nm，与OD 280 nm。，然后根据两种波长的吸收度的比值，通过经验公式校正，以消除核酸的影响而推算出蛋白质的真实含量。 本法操作简便迅速，且不消耗样品(可以回收)，多用于纯化之蛋白质的微量测定。主要缺点：当待测的蛋白质与标准蛋白质中的酪氨酸和色氨酸含量差异较大时，则产生—定误差，混有核酸时必

实验原理】 酶的特异性是指酶对它所催化的反应以及底物结构有严格选择性，一种酶只对一种物质或一类结构相似的物质起作用。酶比一般催化剂特异性强，因酶是一种蛋白质，结构复杂，在其精细的空间构象中，存在一个特殊部分“活性部位”，能专一地与对应的底物结合，体现酶的特异性。 本实验以蛋白酶和淀粉酶对相应底物蛋白质及淀粉的作用为例。来观察酶的特异性，实验结果的检查根据酪蛋白水解生成酪氨酸，酪氨酸与福林 试剂 呈蓝色反应，淀粉能与碘起蓝色或兰紫色反映来确定。 【实验材料】 1. 实验器材 试管及试管架；移液管；烧杯；恒温水浴锅； 温度计 2. 实验 试剂 ⑴ 1% 淀粉溶液：将1g淀粉溶解于100ml蒸馏水中。 ⑵ 1%酪蛋白溶液: 称取酪蛋白1克于研钵中，先用少量蒸馏水湿润后，慢慢加入 0.2mol/L NaOH 4ml，充分研磨，用蒸馏水洗入100ml容量瓶中，放入水浴中煮沸15分钟,溶解后冷却，定容至100ml，保存于冰箱内。 ⑶ 1/2000碱性蛋白酶溶液: 精确称取干酶粉

差异显示方法的基本原理是将具有可比性的细胞在某一条件下可表达的mRNA 群体通过逆转录方法变成相应的cDNA 群体，以此为模板，利用一对特殊引物，即3anchor 引物和5arbitrary引物，在一定条件下进行PCR扩增，得到与mRNA相对应的标签（tags），然后用变性聚丙烯酰胺测序胶分析其差别，将有差别的基因克隆化，进一步分析其结构与功能。 差异显示方法的优点在于：（1）仅需0.2ug总RNA作为起始材料；（2）可同时分析多组样品；（3）敏感性高，可检出低丰度mRNA；（4）实验周期短，约8天即可完成［7］，便于重复；（5）最突出的优点是实验过程中可步步验证比较。差异显示方法方法因有上述优点，被广泛应用。但也存在的不少问题，概括起来有两方面：一是假阳性多（约50％～70％），二是得到的有差异cDNA片段短（约为110～500 bp）。为了解决这一问题Qbiogene和 KPL公司分别开发了第二代的差异显示技术。 第二代差异显示系统 限制性酶切片段差异展示（RFDD-PCR）系统，解决了在标准差异显示中重复性的问题。在这些

【 实验原理 】 　　与大多数化学反应一样，温度对酶活性有显著影响。在一定的温度范围，酶的活性通常随着温度的升高而升高，因为有更多的分子成为活化分子。反之，下降。通常温度每升高10℃，反应速度加快一倍左右，最后反应速度达到最大值。另一方面，酶是一种蛋白质，温度提高可引起蛋白质变性，导致酶活性逐渐丧失。因此，每种酶都有它的最适温度，即酶促反应速度达最大值时的温度。如果反应温度超过最适温度，随着温度的升高，反应速度逐渐下降，以至完全停止反应。通常酶的最适温度接近于它所存在的生物体的温度，比如，人体中的大多数酶的最适温度是37℃左右。本实验以唾液淀粉酶在不同温度下对淀粉的作用为例，观察温度对酶活性的影响, 唾液淀粉酶催化淀粉水解生成各种不同大小分子糊精及麦芽糖，它们遇碘各呈不同的颜色。从而判断淀粉酶是否存在及其酶活性大小。 【 实验材料 】 　　1. 实验器材 试管及试管架；漏斗；烧杯；恒温水浴锅；温度计 　　2. 实验 试剂 　　⑴ 1% 淀粉溶液：同酶特异性实验 　　⑵ 碘-碘化

一、说明 本指南的目的在于向客户介绍用于表达谱芯片的样品制备的一般原则以及我公司对于客户样品的基本要求。包括在样品采集、制备、贮存、运输各阶段需要遵循的一般原则、注意事项等，以及我公司基于对样品质量和数量的要求而提供的各种类型样品的采集、制备等方面建议流程(在满足我公司样品要求的范围内,所有操作规程仅供客户参考)。 二、样品制备的基本原则 代表性原则：取样的代表性直接关系到实验结果的最后解释。应该根据您的实验目的慎重选择您的取样方案，包括样品类型（单一或混合组织类型，单一或混合细胞类型等），取样的操作流程，对照组的设定。基本要求是实验处理组和对照组的样品在取材方式和处理条件等方面尽可能保持一致，否则可能会影响实验结果的可信度。 准确性原则：取样的准确性直接关系到实验结果的科学意义。所有样品（实验组和对照组）的取材必须快速准确同时立即进行后续处理（样品固定化或RNA提取），以减少外界因素对样品原始特性的改变，否则最后的实验结果将难以反映样品的真实特性。 规范性原则：实验过程的操作包括样品收集、

【实验原理】 酶活力受环境pH的影响，在一定pH下，酶表现最大活力，高于或低于此pH，酶活力降低，通常把表现出酶最大活力的pH称为该酶的最适pH。pH影响酶活力的主要原因有以下几个方面，首先，pH影响酶分子活性部位上有关基团的解离，另外，也影响底物的解离状态，从而影响酶活性中心与底物的结合或催化。其次，有关基团解离状态的改变影响酶的空间构象，甚至会使酶变性。尽管有一些酶能忍受较大的pH的变化，但大多数酶保持活性的pH值范围很窄。正因如此，生物体使用缓冲液调节体内的适宜pH值。 【实验材料】 1. 实验器材 试管及试管架；漏斗及滤纸；恒温水浴锅；温度计；移液管 2. 实验 试剂 ⑴ 1% 酪蛋白溶液：同酶的特异性实验 ⑵ 1/2000碱性蛋白酶溶液：同酶的特异性实验 ⑶ pH10 硼砂氢氧化钠缓冲液: 同酶的特异性实验 ⑷ 0.1mol/L盐酸 ⑸ 0.2 mol/L 氢氧化钠溶液 ⑹ 0.4 mol

蛋白质是一切生命活动的基础，受基因表达的调控，因而以检测样品中的mRNA为基础的cDNA芯片是当今研究中倍受关注的研究手段。但是，由于存在着转录后加工、翻译调控以及翻译后加工等多种调节机制，基因的表达，或者说mRNA的水平并不必然代表蛋白质产物的水平。因此，以微阵列技术对生物样品作整体蛋白质表达分析的蛋白芯片在后基因组时代越来越受重视。抗体芯片（Antibody Microarray，抗体微阵列），是蛋白质芯片的一种，是检测生物样品中蛋白表达模式的新方法。这种新技术使得研究人员可以在一次实验中比较生物样品中成百上千的蛋白质的相对丰度，将极大促进蛋白质组目前的研究状况——因为以现有的技术中对蛋白质进行这种复杂的分析是非常困难的。 Clontech公司第一代的抗体芯片Ab Microarray 380（Cat.No.K1847-1）包含固定在玻璃片基上的378种已知蛋白质的单克隆抗体，可以在一次简单实验中同时检测样品中的378种蛋白质的表达情况，并且可以在一张芯片上对两种样品的表达模式进行比较分析。这使得抗体芯片在毒性实验、疾病研究和药物开发上有

离心是蛋白质、酶、核酸及细胞亚组分分离的最常用的方法之一，也是生化实验室中常用的分离、纯化或澄清的方法。尤其是超速冷冻离心已经成为研究 生物 大分子实验室中的常用技术方法。 离心机(centrifuge)是实施离心技术的装置。离心机的种类很多，按照使用目的，可分为两类，即制备型离心机和分析型离心机。前者主要用于分离 生物 材料，每次分离样品的容量比较大，后者则主要用于研究纯品大分子物质，包括某些颗粒体如核蛋白体等物质的性质，每次分析的样品容量很小，根据待测物质在离心场中的行为(可用离心机中的光学系统连续地监测)，能推断其纯度、形状和相对分子质量等性质。这两类离心机由于用途不同，故其主要结构也有差异。 离心原理 将样品放入离心机转头的 离心管 内，离心机驱动时，样品液就随 离心管 做匀速圆周运动，于是就产生了一个向外的离心力。由于不同颗粒的质量、密度、大小及形状等彼此各不相同，在同一固定大小的离心场中沉降速度也就不相同，由此便可以得到相互间的分离。 离心力和相对离